反式7，8-二羥-9，10-環(huán)氧苯并（a）芘誘發(fā)細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、苯并(a)芘(BaP)屬于多環(huán)芳烴類(PAHs)環(huán)境化學(xué)污染物,主要由煤、煙草和其它一些有機(jī)化合物高溫加熱或燃燒不完全時(shí)產(chǎn)生.苯并(a)芘在體內(nèi)經(jīng)微粒體酶代謝活化后生成終致癌物7,8-二羥-9,10-環(huán)氧苯并(a)芘(benzo(a)pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide,BPDE),其中反式-BPDE是代謝產(chǎn)物中活性最強(qiáng)的,具有親電性碳原子活性基團(tuán),能與組成核酸的堿基和組成蛋白質(zhì)的氨基酸的親核基團(tuán)共價(jià)結(jié)

2、合形成加合物,損傷生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能,從而引發(fā)核苷酸切除修復(fù),DNA跨損傷復(fù)制,細(xì)胞周期"校正點(diǎn)"等信號(hào)通路的激活,以及基因表達(dá)的改變. BPDE是一個(gè)全致癌物,兩階段致癌實(shí)驗(yàn)表明它既是致癌劑又是促癌劑.其中,BPDE在癌變發(fā)生啟動(dòng)期的機(jī)制已經(jīng)得到了廣泛研究,主要是導(dǎo)致DNA突變形成:BPDE第10位上的C與DNA鳥嘌呤的N<'2>位形成加合物(+)-trans-anti-BPDE-N<'2>-dG,它們將阻斷DNA復(fù)制,通過

3、細(xì)胞的DNA合成機(jī)構(gòu)的旁路合成途徑,即跨損傷DNA合成(translesion DNA synthesis,TLS),細(xì)胞可以避免這些未經(jīng)修復(fù)的損傷對(duì)細(xì)胞的致死性影響,但在損傷堿基的對(duì)面常插入錯(cuò)配的堿基,通常是G→T的堿基顛換突變,導(dǎo)致細(xì)胞面臨基因突變的風(fēng)險(xiǎn). 與BPDE的致突變機(jī)制廣泛研究相反的是,BPDE誘發(fā)的細(xì)胞早期反應(yīng)中是如何影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而激活轉(zhuǎn)錄因子和它們的靶基因表達(dá)所知甚少.現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)BPDE作用后p53,

4、PI-3K/Akt/JNKs,MAPKs/AP-1,IKKbeta/NF-kappaB等信號(hào)通路被激活.為了研究BPDE對(duì)基因表達(dá)的直接影響,用DNA免疫沉淀技術(shù)鑒定并克隆BPDE結(jié)合的DNA片段,總共得到67個(gè)基因片段.這些片段經(jīng)測(cè)序并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST之后,發(fā)現(xiàn)其功能包括DNA修復(fù),凋亡相關(guān),鋅指蛋白,酶,表達(dá)序列標(biāo)簽克隆,CpG島.這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步說明BPDE與相關(guān)基因DNA直接結(jié)合也是誘導(dǎo)基因表達(dá)變化的一個(gè)重要機(jī)制.

5、與此同時(shí),高通量的基因芯片技術(shù)也被用于檢測(cè)BPDE暴露后,細(xì)胞中基因發(fā)生的全局變化和涉及的信號(hào)通路.Akerman等用含有350個(gè)人類基因的芯片發(fā)現(xiàn)BPDE處理后改變的基因涉及:細(xì)胞周期調(diào)控,谷胱甘肽解毒,細(xì)胞凋亡等等. 在毒理學(xué)研究中,我們通常要考慮細(xì)胞或動(dòng)物暴露于環(huán)境污染物后的劑量反應(yīng)關(guān)系.但是,用能誘導(dǎo)非毒性、亞毒性或毒性反應(yīng)的不同濃度的外來污染物作用后,有時(shí)候不一定能得到良好的劑量依賴關(guān)系,甚至于能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生完全不同的

6、反應(yīng).Moller等人的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)用低、中、高三個(gè)濃度道諾紅菌素(daunorubicin)處理細(xì)胞后,差異蛋白質(zhì)組顯示道諾紅菌素能導(dǎo)致20個(gè)蛋白的表達(dá)水平在三個(gè)濃度都上調(diào),大部分不具有劑量依賴關(guān)系. 除了暴露劑量,暴露后的時(shí)間間隔也是一個(gè)需要考慮在內(nèi)的重要因素.隨著暴露后時(shí)間的延長(zhǎng),可以發(fā)現(xiàn)與時(shí)間相關(guān)毒性反應(yīng)的可觀察的基因或蛋白表達(dá)改變,有助于了解早期反應(yīng)和晚期反應(yīng)的作用機(jī)制和尋找相關(guān)的生物標(biāo)記物. 本實(shí)驗(yàn)室曾用苯并

7、[a]芘處理細(xì)胞,引起廣泛的蛋白表達(dá)改變,其中以鋅指蛋白和一些參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的蛋白多見.為了消除苯并[a]芘的代謝轉(zhuǎn)化效率差異的影響,我們隨后采用苯并[a]芘的代謝終產(chǎn)物BPDE進(jìn)行深入研究,用低濃度0.005gM BPDE處理FL細(xì)胞,在細(xì)胞外液中發(fā)現(xiàn)有3個(gè)出現(xiàn)的蛋白點(diǎn),16個(gè)表達(dá)上調(diào)的蛋白點(diǎn).為了更好的了解細(xì)胞反應(yīng)的全貌,實(shí)驗(yàn)中還用不同的暴露劑量以期獲得更多的信息來闡明細(xì)胞對(duì)BPDE的應(yīng)答機(jī)制.應(yīng)用基因芯片技術(shù)分別檢測(cè)0.005μM、

8、0.05gM、0.5μMBPDE暴露后基因表達(dá)的改變并用實(shí)時(shí)定量RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)在低濃度0.005μM和0.05μM濃度組發(fā)生改變的基因較少,而高濃度0.5μM發(fā)生改變的基因數(shù)目較多,這些基因的功能涉及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子、代謝有關(guān)的酶等.可能涉及的信號(hào)通路包括:p53,MAPK,Akt/PKB.劉更等發(fā)現(xiàn)用低濃度0.005μgM和0.05μM BPDE可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticul

9、um stress,ER stress),但較高濃度0.5μM BPDE未見類似變化. 以上這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果使我們迫切想揭示不同濃度BPDE暴露和暴露后不同時(shí)間細(xì)胞發(fā)生的變化.近年來,生物技術(shù)的飛速發(fā)展使得更全面廣泛的了解這種變化成為可能.許多高通量技術(shù)如cDNA芯片,實(shí)時(shí)RT-PCR,以及生物信息學(xué)已被用于細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng),實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人鼓舞.但是這些技術(shù)都不能提供轉(zhuǎn)錄后的尤其是蛋白質(zhì)在翻譯后修飾的信息,而蛋白質(zhì)通常是細(xì)胞內(nèi)的功能執(zhí)行者

10、.以雙向電泳(2-DE)作為分離技術(shù)和質(zhì)譜作為鑒定技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)的方法能同時(shí)分離細(xì)胞內(nèi)幾千個(gè)蛋白,并能研究翻譯后修飾以及蛋白的相互作用,因此在相關(guān)領(lǐng)域中受到廣泛的應(yīng)用. 因此,在本研究中,應(yīng)用雙向電泳和基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)相結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)方法來篩選不同濃度BPDE暴露和暴露后不同時(shí)間哺乳動(dòng)物細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白,研究可能存在的差異表達(dá)蛋白與BPDE濃度、作用時(shí)間的關(guān)系,找尋對(duì)BPDE有特異反應(yīng)的蛋

11、白.通過生物信息學(xué)方法對(duì)差異蛋白進(jìn)行分類,探討不同功能蛋白對(duì)BPDE的響應(yīng)可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性影響. 本文用BPDE處理FL細(xì)胞,二甲基亞砜作為溶劑對(duì)照組,然后提取細(xì)胞總蛋白.采用24cm,pH 4-7的IPG膠條及同時(shí)可跑12塊膠的Ettan DALT Ⅱ垂直電泳系統(tǒng)進(jìn)行分離,銀染的膠經(jīng)數(shù)字化成像和圖象分析后發(fā)現(xiàn):量效關(guān)系中有65個(gè)蛋白斑點(diǎn)在BPDE處理后12小時(shí)發(fā)生了顯著的變化.其中有1個(gè)斑點(diǎn)在0.05μM和0.5μM BP

12、DE處理后的細(xì)胞中檢測(cè)到,1個(gè)斑點(diǎn)僅在0.5μM BPDE處理后的細(xì)胞中檢測(cè)到;另外有24個(gè)蛋白斑點(diǎn)在0.005μM BPDE處理后表達(dá)量發(fā)生改變(11個(gè)上調(diào),13個(gè)下調(diào)),24個(gè)蛋白斑點(diǎn)在0.05μM BPDE處理后表達(dá)量發(fā)生改變(16個(gè)上調(diào),8個(gè)下調(diào)),25個(gè)蛋白斑點(diǎn)在0.5μM BPDE處理后表達(dá)量發(fā)生改變(14個(gè)上調(diào),11個(gè)下調(diào)),有10個(gè)蛋白斑點(diǎn)在兩個(gè)處理劑量組都發(fā)生了改變,沒有蛋白斑點(diǎn)在三個(gè)劑量組都發(fā)生改變.進(jìn)一步的,我們切

13、取膠上的差異蛋白斑點(diǎn),然后用特異性的胰酶消化,酶解后的肽段用基質(zhì)輔助的激光解吸離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)鑒定,得到各個(gè)蛋白的肽質(zhì)指紋圖譜(peptide mass fingerprinting,PMF).根據(jù)肽質(zhì)指紋圖,在網(wǎng)上用MASCOI、搜索軟件分別搜尋NCBI的非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)(nrNCBI),46個(gè)蛋白質(zhì)得到了鑒定.這些得到成功鑒定的蛋白質(zhì)功能涉及面非常廣,包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控,細(xì)胞周期,細(xì)胞增殖,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),細(xì)胞骨架

14、,發(fā)育,代謝以及其他功能未明的等等.表明BPDE對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了廣泛的影響. 在時(shí)效研究中發(fā)現(xiàn)用0.05μMBPDE處理后3小時(shí),12小時(shí)和24小時(shí),一共有128個(gè)蛋白斑點(diǎn)的表達(dá)發(fā)生了改變.36個(gè)蛋白斑點(diǎn)在0.05μM BPDE處理后3小時(shí)表達(dá)量發(fā)生改變(11個(gè)上調(diào),25個(gè)下調(diào)),29個(gè)蛋白斑點(diǎn)在0.05μM BPDE處理后12小時(shí)表達(dá)量發(fā)生改變(20個(gè)上調(diào),9個(gè)下調(diào)),69個(gè)蛋白斑點(diǎn)在0.05μBPDE處理后24小時(shí)表達(dá)量發(fā)生改變

15、(35個(gè)上調(diào),34個(gè)下調(diào)),有6個(gè)蛋白斑點(diǎn)在兩個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)都發(fā)生了改變,沒有蛋白點(diǎn)在三個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)都發(fā)生改變.其中84個(gè)斑點(diǎn)得到了成功鑒定.與量效研究相似的是,時(shí)效研究中這些得到成功鑒定的蛋白質(zhì)功能涉及面也非常廣,幾乎涵蓋了量效中改變蛋白的各個(gè)類別.結(jié)論:BPDE作用后細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了廣泛的變化,有眾多蛋白參與了應(yīng)答反應(yīng),這些蛋白涉及到細(xì)胞的不同功能,為進(jìn)一步研究BPDE與機(jī)體交互作用的分子機(jī)制提供了線索,并為尋找人群接觸環(huán)境致癌物后的生物