1、microRNAs參與7,8-二氫二醇-9,10-環(huán)氧苯并(a)芘誘發(fā)的FL細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)研究;2、地塞米松誘導(dǎo)的DNA聚合酶β過(guò)表達(dá)和反義阻斷穩(wěn)定細(xì)胞系的建立.pdf

1、苯并(a)芘-7,8-二氫二醇-9,10-環(huán)氧化物(benzo(a)pyrene-7,8-diol-9,10-epoxide,BPDE)是多環(huán)芳烴類(lèi)(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)環(huán)境化學(xué)污染物苯并(a)芘(BaP)在體內(nèi)經(jīng)微粒體酶代謝活化的產(chǎn)物,被認(rèn)為是BaP的終致癌物。BPDE具有親電性碳原子活性基團(tuán),能與組成核酸的堿基和組成蛋白質(zhì)的氨基酸親核基團(tuán)共價(jià)結(jié)合形成加合物,損傷生物大分子的結(jié)構(gòu)

2、和功能。BPDE損傷不是一個(gè)細(xì)胞被動(dòng)接受的過(guò)程,DNA損傷會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)核苷酸切除修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯、激活低保真度的跨損傷復(fù)制等保護(hù)性機(jī)制,以及p53,PI-3K／Akt／JNKs,MAPKs／AP-1,IKKβ／NF-κB等信號(hào)通路被激活。
　　 為了全面了解細(xì)胞對(duì)BPDE的早期應(yīng)答反應(yīng),揭示其致癌機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)室采用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,在全基因組和蛋白質(zhì)水平對(duì)FL細(xì)胞在BPDE暴露后引起的早期細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)做了系統(tǒng)的研究.

3、采用Affymetrix HG-U133 Set(～33000個(gè)基因)全基因組芯片來(lái)篩選FL人羊膜上皮細(xì)胞BPDE處理后4 h的應(yīng)答基因發(fā)現(xiàn),在基因表達(dá)水平引起1764個(gè)差異表達(dá)基因。這些BPDE的應(yīng)答基因功能涉及廣泛,包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié),轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),RNA剪接、蛋白質(zhì)／脂類(lèi)代謝、細(xì)胞骨架、胞內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、DNA修復(fù)和DNA損傷反應(yīng)等；涉及的信號(hào)通路包括:p53、Ras／MAPK、Akt／PKB、PKC、Wnt和TGFbeta通路

4、等。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,對(duì)應(yīng)答效應(yīng)蛋白進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)量效關(guān)系中有65個(gè)蛋白斑點(diǎn)在BPDE處理后12小時(shí)發(fā)生了顯著的變化.時(shí)效研究中一共有128個(gè)蛋白斑點(diǎn)的表達(dá)發(fā)生了改變。MALDI-TOF鑒定的結(jié)果表明,這些得到成功鑒定的蛋白質(zhì)功能涉及面非常廣,包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控,細(xì)胞周期,細(xì)胞增殖,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),細(xì)胞骨架,發(fā)育,代謝以及其他功能未明的等。全基因組芯片表達(dá)譜和蛋白組學(xué)的研究表明:BPDE作用后細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了廣泛的變化,揭示了細(xì)胞對(duì)BPDE應(yīng)答機(jī)制

5、的復(fù)雜性。但是表達(dá)譜芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)有1764個(gè)基因表達(dá)發(fā)生改變,而蛋白質(zhì)組學(xué)僅發(fā)現(xiàn)194個(gè)蛋白的改變,除去由于技術(shù)限制的原因,可能細(xì)胞內(nèi)還存在翻譯水平抑制眾多基因表達(dá)的機(jī)制.對(duì)此問(wèn)題的研究,引起我們濃厚的興趣。
　　 近年來(lái)的研究表明,MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)廣泛存在于真核生物中,由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度為～21-24核苷酸的非蛋白編碼單鏈小分子RNA,在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中起著的重要的作用。miRNA通過(guò)堿基配對(duì)介導(dǎo)序列特異

6、性的基因沉默作用,包括降解靶mRNA和抑制靶mRNA的翻譯.我們推測(cè)miRNA也參與了BPDE的早期細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng),為了證實(shí)這一想法,我們采用microRNA芯片和qRT-PCR研究了miRNA在BPDE早期暴露細(xì)胞應(yīng)答中的作用。microRNA芯片分析采用聯(lián)川公司miRNA14.0版μParaflo(R)雙色標(biāo)記微陣列芯片,分析了在0.5μM濃度BPDE處理后2小時(shí)組和DMSO對(duì)照組中miRNAs表達(dá)譜的變化。
　　 結(jié)果:與對(duì)

7、照組相比,在處理組表達(dá)改變的miRNA和miRNA*有41個(gè)(p<0.1),其中18個(gè)表達(dá)下調(diào),23個(gè)表達(dá)上調(diào)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析篩選出有顯著性差異表達(dá)的miRNAs有10個(gè)(p<0.05),其中上調(diào)的有5個(gè),下調(diào)的有5個(gè)；miRNAs*有4個(gè),其中上調(diào)2個(gè),下調(diào)2個(gè)。qRT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果用Taqman miRNA qRT-PCR試劑盒,在芯片樣品和新處理樣品,驗(yàn)證了顯著性表達(dá)差異的miRNAs中選出的7個(gè)miRNA。
　　 結(jié)

8、果:發(fā)現(xiàn)has-miR-509-5p是主要發(fā)生改變的miRNA基因(p<0.01),比對(duì)照表達(dá)上調(diào)1.8倍,與芯片結(jié)果相一致。
　　 Inhibtor抑制miR-509-5p基因在BPDE誘導(dǎo)的FL細(xì)胞中表達(dá)。
　　 將合成的miR-509-5p inhibitor寡核苷酸片段和對(duì)照寡核苷酸片段,轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)72h后,分別用含BPDE或DMSO的無(wú)血清培養(yǎng)基處理2h,換新鮮全培養(yǎng)基培養(yǎng)液培養(yǎng)2h。收集細(xì)胞,TRIzol試

9、劑提取總RNA,qRT-PCR檢測(cè)miR-509-5p在各組中的表達(dá)。
　　 結(jié)果:轉(zhuǎn)染對(duì)照序列組不影響B(tài)PDE誘發(fā)的miR-509-5p基因表達(dá)上調(diào),而轉(zhuǎn)染inhibtor組,DMSO處理細(xì)胞中miR-509-5p基因的表達(dá)被下調(diào),與Control組DMSO處理細(xì)胞相比,抑制效率達(dá)60％(p<0.01)；BPDE處理不再誘導(dǎo)其表達(dá)的上調(diào)。miR-509-5p靶基因預(yù)測(cè)用靶基因預(yù)測(cè)軟件Target scan5.1預(yù)測(cè)miR-50

10、9-5p靶基因。結(jié)果:得到受miR-509-5p調(diào)控的靶基因265個(gè)。
　　 將預(yù)測(cè)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室全基因組篩出的有顯著性差異表達(dá)的基因進(jìn)行配對(duì)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有65個(gè)共同的基因。從中挑選出CDC14、DOCK4、EIF5B、IGF1R、MEIS1、NF1、PRKCA、RREB1、RAD23B、TDG、TET1、等11個(gè)重要的靶基因,進(jìn)行后續(xù)靶基因分析。qRT-PCR驗(yàn)證篩出的miR-509-5p靶基因用Takara SYBR Gr

11、een qRT-PCR試劑盒,在芯片樣品、新處理樣品、轉(zhuǎn)染miR-509-5p基因inhibitor樣品,檢測(cè)分析挑選的11個(gè)靶基因的表達(dá)變化,找出受miR-509-5p調(diào)控的靶基因。
　　 結(jié)果:在芯片樣品和新處理樣品中CDC14、DOCK4、IGF1R、MEIS1、NF1、PRKCA、RREB1、RAD23B等8個(gè)基因在BPDE暴露后2h表達(dá)均顯著性下調(diào)(p<0.01).在miR-509-5p基因表達(dá)抑制樣品中,CDC14B

12、,DOCK4,IGF1R,MEIS1,NF1,PRKCA,RREB1等7個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)(p<0.01),而RAD23B改變不明顯。
　　 結(jié)論:
　　 a.首次證實(shí)miRNAs參與了BPDE引起的FL細(xì)胞早期應(yīng)答反應(yīng),確認(rèn)miR-509-5p是FL細(xì)胞早期應(yīng)答反應(yīng)的miRNA。
　　 b.首次證實(shí)了mir-509-5p通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)解節(jié)抑制靶基因CDC14B,DOCK4,IGF1R,MEIS1,NF1,PRKC

13、A,RREB1等的表達(dá)。這些基因功能涵蓋細(xì)胞骨架穩(wěn)定、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等。說(shuō)明mir-509-5p在BPDE引起的FL細(xì)胞早期應(yīng)答反應(yīng)中起著重要作用,是細(xì)胞對(duì)BPDE早期應(yīng)答的分子標(biāo)志物。
　　 c.這些新的發(fā)現(xiàn)對(duì)了解BPDE致癌效應(yīng)早期的分子機(jī)制提供了新的理論基礎(chǔ)。
　　 基因組持續(xù)受到各種內(nèi)源性和外源性因子的損傷,為了保證正常的生長(zhǎng)控制與遺傳信息DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性,修復(fù)這些損傷是保持基

14、因組穩(wěn)定性的關(guān)鍵。修復(fù)失敗則導(dǎo)致基因突變,進(jìn)而增加細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。其中DNA堿基修改,如脫氨,烷基化和氧化,或由于自發(fā)脫嘌呤形成的無(wú)嘌呤／嘧啶(AP)位點(diǎn)等損傷出現(xiàn)最頻繁。這些小的DNA損傷主要通過(guò)堿基切除修復(fù)(bage excision repair,BER)途徑來(lái)完成。DNA聚合酶β(DNA polymerageβ,polβ)是BER修復(fù)途徑中不可替代的酶,因此,polβ被認(rèn)為在堿基損傷修復(fù)和基因組完整性的維持中其關(guān)鍵作用,實(shí)驗(yàn)證明

15、polβ下調(diào)或polβ基因突變都會(huì)導(dǎo)致由于DNA修復(fù)缺陷的基因突變。然而,近年來(lái)的研究表明,polβ可能參與了廣泛的DNA代謝反應(yīng),包括DNA復(fù)制,重組,減數(shù)分裂和DNA跨損傷合成等,但在合成的DNA鏈上表現(xiàn)為高堿基錯(cuò)配率。這種錯(cuò)誤配對(duì)可能是由于polβ干擾了其他精確DNA聚合酶的正常功能,而其本身又缺乏3'→5'缺乏校對(duì)活性,使得其復(fù)制保真度下降,導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定.因此,建立誘導(dǎo)型polβ穩(wěn)定高表達(dá)表達(dá)和表達(dá)下調(diào)細(xì)胞系,并利用建立的細(xì)

16、胞系,研究polβ生物學(xué)功能的變化,對(duì)了解DNA polβ表達(dá)改變引起的基因突變和基因組不穩(wěn)定機(jī)制具有重要的理論意義。
　　 在本研究中,我們構(gòu)建了誘導(dǎo)型反義阻斷和表達(dá)DNAPolβ的真核表達(dá)載體,然后將構(gòu)建的地塞米松(dexamethasone,DEX)誘導(dǎo)的真核表達(dá)載體pMAMneo-amp-pol-β-,pMAMneo-amp-pol-β+和對(duì)照pMAMneo-amp-,分別轉(zhuǎn)染FL細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞用含400μg／LGene

17、ticin(G418)的MEM培養(yǎng)基篩選,直至細(xì)胞集落生成,挑取單集落擴(kuò)大培養(yǎng),建立了FL-pMAMneo-amp-,FL-pol-β-和FL-pol-β+細(xì)胞系。建立的細(xì)胞系用DEX誘導(dǎo)72小時(shí)后的qRT-PCR和免疫印跡分析表明:FL-pol-β細(xì)胞中Polβ的表達(dá)比對(duì)照顯著下調(diào),FL-pol-β+細(xì)胞中Polβ的表達(dá)比對(duì)照顯著上調(diào)。此外,MNNG的敏感性試驗(yàn)表明:與對(duì)照相比,Polβ表達(dá)下調(diào)的FL-pol-β細(xì)胞對(duì)烷化劑MNNG.