中國野生葡萄新基因轉(zhuǎn)化歐洲葡萄品種的研究.pdf

1、無核葡萄是當今世界葡萄消費和育種的重要方向之一，但生產(chǎn)上主要栽培的歐洲葡萄無核品種抗病性差，中國野生葡萄是抗葡萄真菌病害的重要基因資源。通過向歐洲葡萄無核品種轉(zhuǎn)移抗病基因是培育抗病無核品種的有效途徑。利用課題組通過mRNA差顯技術(shù)從中國野生葡萄高抗白粉病的華東葡萄白河-35-1中克隆的與抗白粉病相關(guān)的基因乙二醛氧化酶新基因cDNA全長序列，通過構(gòu)建表達載體pWR306-GLOXrg，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對歐洲無核葡萄品種無核白、底來特和愛莫

2、無核及煙草，進行了轉(zhuǎn)基因研究。 取得的主要結(jié)果： 1.無核葡萄試管苗的建立 對經(jīng)4℃低溫沙藏的葡萄硬枝，冬季以10％的石灰氮涂芽處理，促進萌芽，用新梢建立葡萄無菌系。對葡萄新梢剪取單芽莖斷進行擴繁。適宜的繼代培養(yǎng)基為NN69+0.1mg/LIBA,生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.1mg/LNAA。 2.葡萄器官再生途徑的建立 以無核葡萄葉片、葉柄及莖斷為外植體，進行再生研究。篩選獲得的適宜培養(yǎng)基分別是

3、，葉片再生：MS+2.0mg/LTDZ+0.1mg/LNAA+500mg/LCH+5g/LPVP；葉柄和莖斷再生：NN69+4.0mg/LTDZ+0.1mg/LNAA+500mg/LCH+5g/LPVP。 3.葡萄胚狀體途徑方式的再生 以愛莫無核自交的胚珠為試材，剝胚進行胚狀體誘導(dǎo)。幼胚在培養(yǎng)基(WP(固)+0.225mg/L6-BA+60g/L蔗糖+2g/L活性炭+500mg/L水解酪蛋白)上胚性愈傷和胚狀體的誘導(dǎo)率為

4、75％；在培養(yǎng)基(WP(固)+1.0mg/LTDZ+60g/L蔗糖+2g/L活性炭+500mg/L水解酪蛋白)上胚性愈傷和胚狀體增殖良好。 4.中國野生葡萄屬乙二醛氧化酶植物表達載體的構(gòu)建 雙酶切重組質(zhì)粒pGEM-T-GLOXrg與中間表達載體pWR306,將GLOXrg基因片段與線性表達載體pWR306進行定向連接，構(gòu)建了芪合成酶基因的植物表達載體。通過酶切、電泳鑒定，證明GLOXrg基因已成功構(gòu)建到植物表達質(zhì)粒pWR

5、306中，將此克隆命名為pWR306-GLOXrg。 5.葡萄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及轉(zhuǎn)基因葡萄植株的獲得 通過對無核白、底來特和愛莫無核的葉片，以及愛莫無核胚珠誘導(dǎo)的胚性愈傷組織和胚狀體以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葡萄遺傳轉(zhuǎn)化的影響因子的探討，確定了轉(zhuǎn)化方法和步驟為：農(nóng)桿菌濃度OD600值為0.2～0.4，侵染葡萄材料8～10min,共培養(yǎng)2天后采用500mg/L的頭孢青霉素進行抑菌處理，以潮霉素濃度梯度進行轉(zhuǎn)化后的篩選。 最初

6、獲得124株潮霉素抗性植株，其中16株為無核白葉片轉(zhuǎn)化后獲得，愛莫無核胚性愈傷及胚狀體轉(zhuǎn)化后獲得108株潮霉素抗性植株。再生的抗性葡萄植株經(jīng)熒光蛋白及PCR檢測，其中9株檢測呈現(xiàn)陽性，均為經(jīng)愛莫無核胚狀體再生而來。初步證明中國野生葡萄屬乙二醛氧化酶已被轉(zhuǎn)化到歐洲葡萄愛莫無核中。 6.煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及檢測 將植物表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌后首先侵染煙草葉片，潮霉素篩選獲得抗性植株經(jīng)熒光蛋白檢測和PCR檢測獲得了56株陽性植株，并已