表達(dá)PRV-vp4基因的重組桿狀病毒和重組偽狂犬病毒的構(gòu)建.pdf

1、豬輪狀病毒(PorcineRotavirus，PRV)屬于呼腸病毒科輪狀病毒屬，是引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原之一，1-4周齡仔豬的發(fā)病率超過80％，死亡率可達(dá)20％，該病在世界范圍內(nèi)分布，其感染引發(fā)的腹瀉已發(fā)展成為一種世界性的疾病，給各國的畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的危害，有效的疫苗接種是目前預(yù)防該病的唯一途徑，而現(xiàn)有疫苗存在著易發(fā)生毒力回復(fù)、異型間免疫效果差的缺憾。偽狂犬病毒(PseudorabiesVirus，PrV)屬于皰疹病毒甲亞科水痘

2、病毒屬，病毒在豬群中的傳播引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙及呼吸系統(tǒng)疾病，有傳播速度快、傳播途徑多、流行范圍廣、致死率高的特點(diǎn)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失，在偽狂犬病的防控中廣泛使用的Bartha-K61株等弱毒疫苗被證明是疫苗研制成功的典范，目前研究熱點(diǎn)正轉(zhuǎn)為利用生物技術(shù)研制重組偽狂犬病毒活載體疫苗方面。 本研究中，首先進(jìn)行了PRV/JL94株的細(xì)胞培養(yǎng)和超離純化，并提取病毒核酸進(jìn)行研究。根據(jù)學(xué)者們的觀點(diǎn)：vp4基因?qū)啝畈《镜闹?/p>

3、病力起著關(guān)鍵性的作用；VP4還是重要的中和性抗原，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，對(duì)機(jī)體有免疫保護(hù)作用；一個(gè)VP4血清型別可能包含幾個(gè)VP7型別，因此選定vp4基因片段研發(fā)疫苗，能減少不同型別間免疫效果差的問題，對(duì)疾病的防控更有現(xiàn)實(shí)意義。學(xué)者們認(rèn)為，vp4基因5端長(zhǎng)750bp的特異性片段主要決定其生物特性，是vp4的主要抗原功能結(jié)構(gòu)區(qū)。所以，本研究根據(jù)JL94/vp4全基因序列，通過RT-PCR技術(shù)克隆其5端1-756bp(包括全部的VP8區(qū)

4、、胰酶區(qū)和VP5的N端)，命名為vp4主要抗原位點(diǎn)基因(vp4MajorAntigenSiteGene，vp4-MASG)并進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明vp4-MASG基因片段與國外分離株CRW-8株、Gottfried株同一基因片段氨基酸同源性分別是96.43％和67％。同型之間高度保守，不同型間差別較大，其中aa81-207變異性最大。 將vp4-MASG同載體pMelBacA連接，與LinearAcMAPV/DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞

5、Sf9，通過3代蝕斑純化，篩選出含有vp4-MASG基因的重組桿狀病毒并表達(dá)出目的蛋白，光密度掃描分析證實(shí)所表達(dá)蛋白占細(xì)胞總蛋白的26％；WesternBlotting顯示所表達(dá)的蛋白有較好的免疫反應(yīng)性；經(jīng)純化的表達(dá)蛋白免疫小鼠所得血清能阻止PRV在MA104細(xì)胞上形成的細(xì)胞病變，說明表達(dá)蛋白有免疫原性。構(gòu)建的表達(dá)PRV/vp4基因的重組桿狀病毒可以作為亞單位疫苗侯選株，它不含有輪狀病毒核酸，不存在毒力回復(fù)問題，高安全性和高表達(dá)量是其最

6、大特點(diǎn)。 輪狀病毒性腹瀉和偽狂犬病是危害養(yǎng)豬業(yè)的兩大重要傳染病，是否可以利用成功的偽狂犬病毒疫苗株作為活載體表達(dá)輪狀病毒基因，力爭(zhēng)同時(shí)防治這兩種疾病呢。實(shí)驗(yàn)中，將vp4-MASG插入到本課題組構(gòu)建的gG偽狂犬病毒轉(zhuǎn)移載體多克隆位點(diǎn)上，該轉(zhuǎn)移載體以偽狂犬病毒非必需基因的部分序列作為同源臂，在其間插入gGPromoter、多克隆位點(diǎn)、PolyA、CMVPromoter及其控制的LacZ基因，構(gòu)建出含有目的基因vp4-MASG和報(bào)告基

7、因LacZ的轉(zhuǎn)移載體vp4-MASG-gG；將其與PrV弱毒疫苗株Bartha-K61株(gE-/gI-)病毒基因組DNA，通過脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，經(jīng)顯微鏡下挑斑技術(shù)的篩選純化及PCR鑒定，獲得了一株表達(dá)目的基因的重組偽狂犬病毒，命名為vp4-MASG-PrV；生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示重組病毒vp4-MASG-PrV在Vero和IBRS2細(xì)胞上的毒價(jià)與親本病毒Bartha-K61無顯著差異，重組病毒去除了偽狂犬病毒的主要毒力基因gG，

8、理論上會(huì)使毒力進(jìn)一步降低而安全性提高，但由于PrV的毒力由多個(gè)毒力基因決定，所以單獨(dú)某些基因的缺失，不足以引起顯著的毒力降低；重組病毒和親本病毒在同種細(xì)胞上引起相似的細(xì)胞病變形態(tài)，不同的細(xì)胞系中產(chǎn)生的CPE形態(tài)不同，CPE形態(tài)與病毒無關(guān)只與細(xì)胞系相關(guān)，說明外源基因的插入并未導(dǎo)致細(xì)胞病變的形態(tài)變化；表達(dá)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，vp4-MASG-PrV在Vero細(xì)胞中表達(dá)出與預(yù)期大小相符合的28kDa蛋白；WesternBlotting實(shí)驗(yàn)和間接免

9、疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，vp4-MASG-PrV感染細(xì)胞15h后VP4蛋白即可通過WesternBlotting在被感染的細(xì)胞中檢測(cè)到，而病毒上清中未檢測(cè)，另一方面被感染細(xì)胞的可以用輪狀病毒抗體檢測(cè)到胞漿熒光，而病毒上清中沒有熒光，說明在表達(dá)特性方面，所表達(dá)蛋白主要分泌到感染細(xì)胞的胞漿中/胞膜上，并且所表達(dá)蛋白有免疫反應(yīng)性；將Balb/C小鼠分為2組，分別肌肉注射vp4-MASG-PrV和生理鹽水對(duì)照，兩次免疫后取血清進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯

10、示重組病毒在機(jī)體中有效地激發(fā)了特異性抗輪狀病毒抗體的產(chǎn)生，有較好的免疫原性。重組偽狂犬病毒在生物學(xué)活性上與作為疫苗株的親本病毒無明顯差異，同時(shí)它有較好的免疫反應(yīng)性和免疫原性，表型特征為gE-/gI-/gG-/vp4+/LacZ+，是有必要進(jìn)一步完善數(shù)據(jù)、進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，有應(yīng)用前景的同時(shí)預(yù)防兩種疾病的重組活載體病毒。 整體實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建出表達(dá)PRV/vp4基因的重組桿狀病毒和重組偽狂犬病毒，它們有各自的特點(diǎn)：作為亞單位疫苗侯選株的重組