酒精對PC12細胞凋亡及神經鞘磷脂循環(huán)的影響.pdf

1、目的：本實驗建立酒精誘導PC12細胞凋亡模型，應用此模型觀察PC12細胞凋亡過程中神經鞘磷脂循環(huán)相關酶活性及mRNA表達量的改變，分析該循環(huán)在神經細胞凋亡中的作用，為進一步研究神經細胞的凋亡機制提供依據。
　　 方法：MTT法測定酒精對PC12細胞增殖的抑制作用；Hoechst33258染色熒光顯微鏡觀察PC12細胞凋亡形態(tài)學變化；DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡梯狀DNA條帶；RT-PCR法檢測酒精對PC12細胞SMS1、SM

2、S2和N-SMasemRNA表達的影響；薄層層析方法測定SMS的活性；熒光分光光度法檢測N-SMase的活性。
　　 結果：MTT法結果顯示，去血清培養(yǎng)的PC12細胞24h，酒精濃度在100mmol/L、200mmol/L、400mmol/L和800mmol/L時，細胞存活率分別是單純去血清的87.54％、70.73％、57.89％和51.70％，表現出較強的細胞增殖抑制作用，與去血清對照組比較差異顯著(P＜0.05)，呈濃度依

3、賴性。含10％胎牛血清的細胞培養(yǎng)組，酒精濃度達到200mmol/L時對細胞的增殖抑制作用不明顯，與正常培養(yǎng)組相比無顯著性差異(P＞0.05)。Hoechst33258熒光染色觀察細胞核形態(tài)學變化，結果顯示，不同濃度的酒精作用PC12細胞24h，酒精處理組凋亡細胞增多，表現染色質凝集，細胞核變小、核碎裂成碎片等典型細胞凋亡特征性變化，凋亡率隨著酒精濃度的增大而升高，去血清組的酒精濃度為100mmoL/L、200mmoL/L和300mmoL

4、/L時，細胞凋亡率分別是19.21±3.2％(P＜0.05)、28.39±5.11％(P＜0.05)和38.68±4.28％(P＜0.01)，呈劑量依賴關系。瓊脂糖凝膠電泳可見100-300mmoL/L濃度酒精處理組有不同程度的DNA斷裂，顯示凋亡細胞典型的梯狀DNA。RT-PCR檢測酒精對PC12細胞SMS和N-SMase基因在轉錄水平表達的影響，結果顯示，不同濃度酒精作用于PC12細胞0.5h，SMS1表達量無顯著變化，當作用時間達

5、1h和2h，SMS1表達量顯著增加，并呈劑量依賴性，而SMS2的mRNA表達則不受酒精作用的影響；不同濃度酒精作用PC12細胞0.5h和1h，N-SMase表達量無顯著變化，作用2h時表達升高。以NBD-神經酰胺為底物，用薄層層析法檢測細胞內總SMS活性，顯示不同濃度酒精作用PC12細胞2h，SMS活性隨酒精濃度增加而升高。熒光分光光度法檢測N-SMase的活性，顯示酒精作用PC12細胞0.5h時N-SMase活性變化不顯著(P＞0.0