美洲商陸抗病毒蛋白（PAP）密碼子的優(yōu)化及其在畢赤酵母中高效表達(dá)的研究.pdf

1、美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)屬于核糖體失活蛋白(RIPs)，能有效抑制植物病毒的侵染，本研究針對缺失型PAP基因在巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)量較低的問題，有目的的利用畢赤酵母偏好的密碼子對缺失型PAP基因密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，調(diào)整或去除影響mRNA穩(wěn)定的堿基序列，以期獲得適于在畢赤酵母中高效表達(dá)的缺失型PAP基因，其主要研究結(jié)果如下： 1.完成了對缺失型PAP基因密碼子的優(yōu)化。以獲得缺失型PAP表達(dá)

2、量較高的轉(zhuǎn)基因巴斯德畢赤酵菌為目的，在不改變野生型基因氨基酸序列的前提下，根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好及密碼子簡并原則，對缺失型PAP基因(GeneBank：AF338910，編碼237個(gè)氨基酸)進(jìn)行下列優(yōu)化改造：使用畢赤酵母菌偏好密碼子，使PAP基因的密碼子符合畢赤酵母表達(dá)外源蛋白時(shí)對密碼子的偏好，提高序列的G+C含量；在改造后的PAP基因3’末端添加終止子，在改造后的序列兩端分別添加NotⅠ及SnabⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，改造后的基因

3、命名為PAPs。 2.人工合成了PAPs基因序列，構(gòu)建了其克隆載體T-easy-PAPs。在上述密碼子優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上確定了人工合成全基因的引物序列，通過5輪連續(xù)延伸PCR反應(yīng)及一次定點(diǎn)突變得到了改造后的PAPs全序列，合成的新基因克隆到通用載體T-easy上。改造后的基因中有74.1％的密碼子為畢赤酵母偏好的密碼子，序列的G+C含量由38.7％提升為45.1％。 3.構(gòu)建了PAPs基因的分泌型酵母表達(dá)載體pPIC9k-

4、PAPs。pPIC9k系列載體具有α-因子信號序列、含5個(gè)酶切位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)以及His4與Kan雙篩選標(biāo)記。表達(dá)載體在轉(zhuǎn)化酵母菌宿主時(shí)，可整合到酵母菌的基因組染色體上，得到帶有選擇標(biāo)記的重組子。 4.獲得了轉(zhuǎn)PAPs基因的重組酵母菌株。將表達(dá)載體pPIC9k-PAPs與空載體pPIC9k經(jīng)限制性內(nèi)切酶SalⅠ線性化后，電激轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母GS115菌株細(xì)胞中，通過PCR篩選出Mut+與Muts重組子。 5.驗(yàn)證了M

5、ut+重組子表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒活性。Western-blot結(jié)果表明：在甲醇誘導(dǎo)條件下表達(dá)的外源蛋白與PAP抗血清有明顯的雜交信號。抗病毒活性測定結(jié)果也表明，表達(dá)的蛋白具有抑制病毒侵染的活性。 6.明確了搖瓶培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇濃度、培養(yǎng)基pH值等誘導(dǎo)條件對Mut+重組菌株表達(dá)PAPs基因的影響。結(jié)果表明：Mut+重組菌株在甲醇誘導(dǎo)第五天表達(dá)量達(dá)到最高水平，延長誘導(dǎo)時(shí)間會導(dǎo)致表達(dá)量下降；在1％的甲醇濃度誘導(dǎo)下，PAP能得到最佳