面神經離斷傷后核團微環(huán)境中NG2蛋白表達和NG2陽性細胞反應的研究.pdf

1、研究背景：面神經位置表淺，出顱后行程復雜易變，各種外傷或鄰近部位的手術均易造成其損傷，導致部分性或完全性面癱，嚴重影響功能和外觀。盡管目前各種神經修復技術日趨精益，但臨床觀察發(fā)現術后神經功能的恢復難臻滿意。究其主要原因，面神經損傷后不但外周神經干發(fā)生退行性變，而且中樞核團內也發(fā)生了極為復雜的反應。神經元核團微環(huán)境的營養(yǎng)和導向作用對受損神經的有效再生具有重要意義。而在中樞神經系統中，膠質細胞廣泛分布，對神經元起物理支持、提供營養(yǎng)、維持周遭

2、液體環(huán)境穩(wěn)定、形成髓鞘、絕緣保護、清除病原體和死亡神經元等多種作用。因此，加強對面神經損傷后核團內膠質細胞微環(huán)境的認識，可以為其修復再生提供一定的理論基礎。目前，已有大量實驗研究表明，小膠質細胞、星形膠質細胞在面神經離斷后核團區(qū)發(fā)生了一系列的反應。然而，對于近來發(fā)現的，同樣廣泛存在于CNS中，能對多種中樞神經系統疾病或損傷作出強烈反應的NG2陽性細胞，在面神經核團區(qū)生理和病理情況下均未見研究報道。而且這類細胞的功能和作用尚未明確，并在來

3、源屬性上存在極大爭議。本課題擬對面神經損傷后核團膠質細胞微環(huán)境中的NG2蛋白表達和NG2陽性細胞的反應加以研究，并明確其來源屬性，探討其對受損神經元的作用，為面神經損傷后的神經元的保護提供一定的理論基礎。
　　 目的：(1)建立大鼠面神經莖乳孔處壓榨、切斷、抽脫模型，系統比較不同受損模式下面神經元變化的差異，為針對不同研究目的選擇動物模型提供依據；(2)觀測面神經離斷術后不同時間點核團內NG2蛋白的表達變化，比較NG2陽性細胞與

4、小膠質細胞、星形膠質細胞的反應差異；(3)探討面神經離斷后核團內NG2陽性細胞的來源和屬性；(4)探討面神經核團內反應性增殖的NG2陽性細胞對受損神經元的可能性作用。
　　 方法：(1)建立大鼠面神經莖乳孔處壓榨、切斷、抽脫模型，按術后1天、2天、7天、14天、28天分組；(2)術后不同時間點的大鼠灌注、固定后，取包含面神經核團區(qū)的腦干部位行系統連續(xù)冰凍切片；(3)不同模型不同時間點的冰凍切片，行Cresyl Violet染色，

5、顯微鏡下拍照后，觀察正常側和受損側核團內面神經元空間形態(tài)學上的不同，并比較不同模型中受損神經元的差異；(4)行ChAT免疫組化染色，對核團區(qū)陽性神經元進行計數，并以每只動物一套切片手術側與對照側陽性神經元總數的比值表達活性神經元比率，進行統計學分析；(5)Western Blot法檢測各組不同時間點兩側核團區(qū)的凋亡相關蛋白Caspase-3的表達，并根據掃描的密度值行半定量數據分析，得出各樣本的Caspase-3/β-actin的值(均

6、數±標準差)，對各組各時間點手術側和對照側的值行student-t檢驗，P＜0.05，認為有顯著性差異；(6)Western Blot法檢測面神經離斷后核團內NG2蛋白表達，并用上述統計學方法分析其時相性變化；(7)應用免疫組化的方法，觀察面神經離斷術后核團區(qū)小膠質細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞和NG2陽性細胞的反應，并比較其差異；(8)通過BrdU增殖實驗結合免疫熒光雙標染色方法，分析NG2陽性細胞的來源、屬性及作用；(9)建立大鼠

7、頂葉針刺傷異位模型，注射熒光乳膠紅顆粒，術后1天、2天、7天行免疫熒光染色觀察NG2陽性細胞的吞噬功能。
　　 結果：
　　 (1)成功構建了面神經莖乳孔處壓榨、切斷、抽脫傷模型；早期動物行為學上均表現為完全性面癱；隨后壓榨組在28天內面神經功能自行恢復，而切斷組和抽脫組呈現永久性面癱。
　　 (2)Cresyl Violet染色顯示，壓榨組僅在術后早期出現面神經元尼氏體的不均勻深染，切斷組則表現出程度不同的凋亡

8、前形態(tài)變化，而抽脫組在術后14天、28天時出現了凋亡神經元。
　　 (3)ChAT免疫組化染色結果表明，壓榨組僅在術后7天左右出現神經元合成和釋放乙酰膽堿遞質能力的減弱，隨后逐漸恢復；切斷組和抽脫組活性神經元比率則逐步降低，與壓榨組相比存在著明顯的組間差異(P＜0.05)。
　　 (4)Caspase-3 Western Blot結果顯示，壓榨組雙側核團區(qū)Caspase-3表達無明顯差異，均處在較低水平，而切斷組在術后7

9、天，抽脫組在術后2天開始受損側與正常側相比出現高表達(P＜0.05)，并在28天內呈逐步增高趨勢。
　　 (5)應用Western Blot方法，首次證實了面神經核團內存在NG2蛋白的表達，并發(fā)現在面神經離斷術后28天內，受損側核團內NG2蛋白呈現規(guī)律時相性變化(術后第2天起逐漸增高，7天時達峰值，隨后逐漸下降，在28天左右降至基線水平)。
　　 (6)免疫組化染色結果顯示，面神經離斷術后小膠質細胞、星形膠質細胞和NG2

10、陽性細胞均發(fā)生了明顯的反應。NG2陽性細胞在術后2天胞體增大，突起變粗，NG2蛋白表達增強，并逐漸增殖遷移；在7天左右時對受損神經元形成了類似于小膠質細胞的緊密包繞，而這種包繞明顯不同于星形膠質細胞對受損神經元所形成的疏松花環(huán)樣簇擁。
　　 (7)應用免疫熒光雙標染色技術發(fā)現，面神經離斷后核團內的NG2陽性細胞由兩種屬性的細胞組成：1、核團內固有的NG2陽性細胞，這部分細胞屬于傳統觀念上的OPC。本實驗中表現為NG2+/PDGF

11、-α-R+/OX42-或NG2+/PDGF-α-R+/Lectin-，但其對面神經離斷傷無明顯反應；2、誘導表達了NG2的活化小膠質細胞，這種細胞在面神經離斷傷后2天逐步出現，并進一步活化增殖，細胞數目在術后7天達到峰值，并同時對受損神經元形成了緊密包繞。
　　 (8)對這種表達NG2蛋白的活化小膠質細胞的功能進行初步分析發(fā)現，NG2陽性突起伸入到受損神經元的輸入或輸出突觸間隙之間，對Synapsin-I標示的突觸末端進行了廣泛

12、的剝離。而其NG2蛋白的表達能夠調節(jié)細胞的增殖、遷移和粘附。進而通過異位模型，證實這種活化的小膠質細胞并不像普通意義下激活的小膠質細胞具有吞噬能力。
　　 結論：
　　 (1)通過對面神經莖乳孔處壓榨、切斷、抽脫三種損傷模型的比較研究發(fā)現，切斷組核團區(qū)大量神經元功能失活，但并沒有發(fā)生徹底性死亡，僅僅是發(fā)生凋亡前變化。在術后28天內進入了功能上的“休眠”狀態(tài)，這與核團區(qū)的膠質細胞微環(huán)境變化存在著很大的關系。
　　

13、(2)研究面神經切斷后膠質細胞微環(huán)境，首次發(fā)現核團區(qū)NG2蛋白的規(guī)律時相性變化，并證實其表達并非作為分泌型蛋白參與膠質瘢痕的形成，而是表達于一類特殊細胞群體表面，作為其活化的標志。
　　 (3)對反應性NG2陽性細胞來源和屬性進行分析，發(fā)現面神經離斷傷后出現的反應性NG2陽性細胞并非傳統意義上的OPC，而是誘導表達了NG2的活化小膠質細胞，這種細胞在面神經離斷傷后2天逐步出現，并進一步活化增殖遷移，對受損神經元形成了緊密包繞。<