Ri質粒介導fps基因轉化煙草的研究.pdf

1、本實驗通過Ri質粒介導fps基因轉化煙草，經過PCR、PCR-Southern、Northern-blot檢測，獲得了四株fps轉基因發(fā)根；對轉基因發(fā)狀根在固體、液體培養(yǎng)條件下進行生長特性研究，并且將發(fā)根株系3在生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)，顯示了利用發(fā)狀根的生產潛能；用粗毒素對轉基因發(fā)根進行誘導，提取其浸提液進行抗病實驗分析，結果表明對赤星病、黑脛病具有明顯的抗性，這為生產安全、高效的生物農藥提供可能途徑。主要結果如下：1.本研究采用凍融法進

2、行pBiARfps質粒轉化野生型Ar1334，獲得Ar1334工程菌株；利用Ar1334工程菌轉化煙草K326，獲得煙草發(fā)狀根，以Ri質粒T-DNA上與發(fā)根相關的rolC基因設計特異性引物，對發(fā)狀根進行PCR擴增，得到了560bp的目的基因片段，證明了Ri質粒T-DNA在煙草發(fā)狀根的基因組中得到了整合；以fps基因設計特異性引物對發(fā)狀根進行PCR擴增，得到了1000bp的目的基因片段，證明了fps基因在煙草發(fā)狀根的基因組中得到整合；利用

3、地高辛標記fps基因探針，對fps基因PCR產物進行PCR-Southern檢測，并且檢測到了目的基因片段的印跡，證明fps基因在發(fā)狀根基因組分子水平得到了表達；用發(fā)狀根基因組RNA進行Northern-blot檢測，也檢測到了目的基因片段印跡，證明fps基因發(fā)狀根基因組轉錄水平得到表達。從而獲得了fps基因煙草發(fā)狀根。 2.煙草發(fā)狀根在固體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，四個轉基因株系除具有發(fā)狀根的一般特性外，還有其各自形態(tài)上的特性；在液體懸浮培

4、養(yǎng)條件下，對轉基因發(fā)狀根的生長特性研究結果表明，煙草轉基因發(fā)狀根呈典型的S型生長曲線，生長周期為30d，生物量的積累在株系間表現(xiàn)比較大的差異，生長最好的株系4生物量達到45.6g/l，最差的株系3也達到18.9g/l；我們將株系3轉到生長條件更好的生物反應器中進行放大培養(yǎng)，結果表明接種，2g/l生物量的發(fā)狀根，培養(yǎng)一個周期后，長滿整個生物反應器，生物量達到94.7g/l，干重達到9.6g/l，進一步顯示了利用發(fā)狀根發(fā)大培養(yǎng)生產有用次生代

5、謝物的生產潛能。 3.用粗毒素誘導培養(yǎng)25d左右的轉基因煙草發(fā)狀根，再利用其浸提液進行抗菌實驗，結果顯示誘導后轉基因發(fā)根抗菌性明顯優(yōu)于非轉基因發(fā)根，株系間也表現(xiàn)明顯的差異，株系3在實驗中表現(xiàn)出其抗菌優(yōu)勢；為了實際應用中得到可靠的證據(jù)，我們利用株系3浸提液進行煙草幼苗抗黑脛病研究，結果表明：外施經過誘導的轉基因煙草發(fā)狀根浸提液后，煙草幼苗抗菌性提高45％，進一步說明轉基因發(fā)根在粗毒素誘導后，激活了植保素的合成途徑，對病原菌的抗性增