Ⅰ抗人大腸癌單鏈抗體基因的構(gòu)建與表達;Ⅱ抗人大腸癌單鏈抗體——胞嘧啶脫氨酶融合基因的構(gòu)建及表達.pdf

1、中國醫(yī)科大學博士學位論文Ⅰ抗人大腸癌單鏈抗體基因的構(gòu)建與表達Ⅱ抗人大腸癌單鏈抗體——胞嘧啶脫氨酶融合基因的構(gòu)建及表達姓名：方瑾申請學位級別：博士專業(yè)：細胞生物學指導教師：宋今丹2001.8.1備的鼠抗人大腸癌單克隆抗體，已進行的近千例臨床病理檢測顯示，該單抗對高中分化大腸癌組織具特異結(jié)合活性，并優(yōu)于目前廣泛采用的美國商業(yè)產(chǎn)品抗CEA單抗。該單抗與天花粉蛋白偶聯(lián)制備的免疫毒素和與載有紫杉醇的脂質(zhì)體偶聯(lián)制備的免疫脂質(zhì)體在體外均顯示了良好的靶

2、向殺傷作用。應用”1l標記的ND一1單抗在裸鼠體內(nèi)的放射免疫顯像亦顯示了良好效果。在此基礎上，本實驗將抗人大腸癌單克隆抗體ND一1的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因進行重組構(gòu)建了單鏈抗體ND一1scFv，并成功地在大腸桿菌中進行了有效表達。在證實ND一1scFv具有滿意的免疫學活性，在動物體內(nèi)呈特異性分布后，將ND一1單抗的單鏈抗體基因與酵母胞嘧啶脫氨酶(cytosinedeaminase，CD)基因融合，在大腸桿菌中成功地表達了單鏈抗體與酶的融合

3、蛋白，并測定了其與5一氟胞嘧啶構(gòu)成的壘望墾墮丕統(tǒng)對靶細胞的殺傷作用，希望為大腸癌的臨床診斷和治療提供新的途徑和手段。／1采用RT—PCR技術(shù)從能夠分泌ND一1單抗的鼠雜交瘤細胞Ic一2節(jié)擴增V。和V?；?，通過重疊延伸拼接PCR在V。和V?；蛐蛄袉栆脒B接短肽，體外構(gòu)建seFv基因，經(jīng)常規(guī)轉(zhuǎn)化和篩選將其克隆至PET一28a()表達載體并由InB誘導在EcoliBL21中表達ND一18cFv蛋白。序列分析表明：ND一1scFv基因全長7

4、32bp，VH基因在上游，片段長度354bp；V?；蛟谙掠?，片段長度330bp，中間為柔性UIll【er序列，長度45bp，兩側(cè)為通過PCR引入的EcoRI和HindⅢ酶切位點，與Genebank中相關(guān)序列比較證實，該scFv片段具有鼠源性抗體特征，由鼠源性抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)組成，輕鏈為K鏈。SDS—PAGE檢測顯示，重組蛋白的相對分子量為30KD，包括8cFv和蛋白標簽6His—tag以及載體上游序列，與理論推算值相符。凝膠

5、灰度掃描結(jié)果顯示seFv蛋白表達量隨誘導時間增加而增加，至4小時達到誘導高峰，表達量占菌體總蛋白量的16％，同時本實驗利用鎳一次氨基三乙酸(Ni—NTAresin)金屬親和層析基質(zhì)對6XHis—tag的特異親和性完成了對scFv的純化，獲得了純度為94％的高純度表達蛋白，蛋白濃度高達15mg／IllI，為該單鏈抗體在臨床的廣泛應用提供了可能。2對誘導表達并經(jīng)純化復性的ND一1scFv進行了間接免疫熒光檢測，結(jié)果顯示，表達有ND一1相應細