基于96孔板法的辣椒cDNA文庫(kù)篩選及AP2 cDNA的分離研究.pdf

1、AP2族轉(zhuǎn)錄因子在植物中以多基因家族的形式存在，在植物適應(yīng)逆境的過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用并具有明顯的功能多樣性。為了開(kāi)展AP2族轉(zhuǎn)錄因子在辣椒逆境脅迫響應(yīng)中的功能分析，本研究利用UV誘導(dǎo)處理的辣椒葉片所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，在優(yōu)化cDNA文庫(kù)篩選方法的基礎(chǔ)上，篩選出2個(gè)AP2(APETALA2)轉(zhuǎn)錄因子的全長(zhǎng)cDNA，另外還利用文庫(kù)為底物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得兩個(gè)AP2轉(zhuǎn)錄因子cDNA部分片段。初步研究了上述cDNA在SA(salicylic

2、acid)、ABA(abscisicacid)、ET(ethylene)、JA(jasmonicacid)等外源信號(hào)物質(zhì)作用下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，主要結(jié)果如下：1、采用基于PCR技術(shù)的96孔板cDNA文庫(kù)篩選法，利用含有AP2轉(zhuǎn)錄因子基因高度保守序列設(shè)計(jì)的引物，篩選cDNA文庫(kù)獲得了2個(gè)全長(zhǎng)的AP2轉(zhuǎn)錄因子的陽(yáng)性cDNA克隆CaAP21、CaAP22以及另外兩個(gè)AP2轉(zhuǎn)錄因子的cDNA片段。測(cè)序結(jié)果表明，CaAP21的長(zhǎng)度為745bp，含有編碼

3、長(zhǎng)度為229個(gè)氨基酸的開(kāi)放讀碼框架；CaAP22長(zhǎng)度為900bp，含有長(zhǎng)度為155個(gè)氨基酸的開(kāi)放讀碼框架，CaAP23長(zhǎng)度為423bp，CaAP24長(zhǎng)度為467bp，上述四個(gè)cDNA的翻譯氨基酸序列均含有保守的AP2域。同源分析結(jié)果表明，所分離的cDNA與已發(fā)表的AP2轉(zhuǎn)錄因子具有不同程度的同源性，其中CaAP21與辣椒乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白(AAX20037)的同源性為79.41％，與煙草乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白(BAA07323)的同源性

4、為54.39％，與番茄乙烯響應(yīng)因子(AAS72389)的同源性為53.36％，與煙草乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白(BAA97124)的同源性為51.39％；CaAP22與擬南芥乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白(AAT44928)的同源性為38.03％，與秈稻乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CAE05154)的同源性為31.23％，與擬南芥乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白(AAT44952)的同源性為29.43％，與擬南芥乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白(BAB08875)的同源性為29.0

5、3％。但是CaAP21、CaAP22、CaAP23、CaAP24彼此之間的除了AP2域外，同源性很低，推測(cè)上述cDNA均為辣椒AP2家族不同成員的cDNA。 2、以辣椒為研究材料，用一定濃度的外源ABA、SA、ET、JA分別處理辣椒幼苗的葉片，于不同時(shí)間段提取總RNA進(jìn)行一步法反轉(zhuǎn)錄半定量RT-PCR。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CaAP21受ABA抑制，受SA和ET激活，不受JA的影響；CaAP22受ABA、SA的激活，不受ET處理的影響，推測(cè)C