五種乳酸桿菌益生菌株對變形鏈球菌生長及生物膜形成影響的研究.pdf

1、[目的]
　　變形鏈球菌（Streptococcus mutans，MS）是一種在口腔中與齲病相關(guān)的最常見的細(xì)菌，乳酸桿菌(lactobacilli bacteria，LB)和雙歧桿菌是最常見的益生菌，同時也被認(rèn)為是齲病的致病菌之一。目前關(guān)于它們對變形鏈球菌作用的研究較少，其抑制變形鏈球菌的機(jī)制還未明確。本研究的目的在于通過菌落計(jì)數(shù)觀察不同種類LB及其上清液對MS生長的作用，并通過熒光顯微鏡觀察LB上清液對MS生物膜的抑制作用，同

2、時研究益生菌對高齲兒童口內(nèi)MS臨床分離株的生長的影響，初步研究LB抑制MS的作用及其作用機(jī)制，探討其預(yù)防齲病的臨床應(yīng)用價值。
　　[材料和方法]
　　1.LB及其上清液對MS的抑菌作用:
　　實(shí)驗(yàn)組選取五種LB菌株(L.casei Shirota,L.casei LC01，L.plantarum ST-Ⅲ，L.paracasei Lpc-37，L.rhamnosus HN001)1×106 CFU/ml,1×108 C

3、FU/ml,3×108CFU/ml三個濃度各0.25 ml，加濃度為1.5×108 CFU/ml MS菌液0.25 ml和1.5 ml BHI液體培養(yǎng)基，對照組LB菌液以金黃色葡萄球菌ATCC25923菌液代替。LB上清液對MS的抑制實(shí)驗(yàn)中，未經(jīng)過和經(jīng)過pH調(diào)節(jié)和超濾處理的五種LB上清液代替上述步驟中的LB菌液，對照組LB上清液以MRS肉湯代替，分別37℃6％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，梯度稀釋，計(jì)數(shù)MS菌落。
　　2.LB對MS

4、生長及生物膜形成的抑制作用:
　　實(shí)驗(yàn)組取1.5×108 CFU/ml濃度的MS懸液0.1ml，加入內(nèi)置蓋玻片的無菌培養(yǎng)皿中，分別加入9.5 ml BHI液體培養(yǎng)基，0.4 ml上述五種LB上清溶液，對照組LB上清液由0.4 ml生理鹽水代替，6％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時獲取和固定生物膜，用0.01％的吖啶橙AO進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察。
　　3.SDS-PAGE
　　LB上清液經(jīng)過超濾后冷凍干燥，溶于100 ul

5、超純水，置于15％的Tris-HCL預(yù)制膠電泳90分鐘，考馬斯亮藍(lán)R250染色攝片觀察。
　　4.對MS臨床分離株的抑菌作用
　　按照ICDAS標(biāo)準(zhǔn)，選取高齲兒童20例作為實(shí)驗(yàn)組，用MSB選擇性培養(yǎng)基從唾液中分離MS，按方法1測定五種LB對MS分離菌株生長抑制情況。同時按方法2制備混合菌斑生物膜并觀察LB對生物膜內(nèi)鏈球菌的影響。
　　[結(jié)果]
　　1.LB及其上清液對MS抑菌作用:五種LB在1×108 CFU/m

6、l，3×108 CFU/ml濃度下可抑制MS的生長(P＜0.05)，未經(jīng)過pH調(diào)節(jié)和超濾處理的五種LB上清液及經(jīng)過pH調(diào)節(jié)和超濾處理處理后的上清液L.casei Shirota和L.rhamnosus HN001對MS生長仍有抑制效果(P＜0.05)
　　2.LB上清液對MS生物膜抑制作用:未經(jīng)過pH調(diào)節(jié)和超濾處理的五種LB上清液都能抑制MS及其生物膜生長(P＜0.05)，經(jīng)過pH調(diào)節(jié)和超濾處理的L.casei Shirota和L

7、.rhamnosus HN001的上清液對MS生物膜仍有抑制效果(P＜0.05)
　　3.LB上清液SDS-PAGE:L.casei Shirota和L.rhamnosus HN001的上清液在6.5kDa處與MRS肉湯對照組相比可見增強(qiáng)的一條條帶。
　　4.LB對MS臨床分離株的抑菌作用:L.casei Shirota，L.casei LC01，L.plantarum ST-Ⅲ，L.paracasei Lpc-37對高齲兒

8、童唾液中MS抑制率分別為72.27％、62.82％、64.42％、68.58％，混合培養(yǎng)后四種LB對變形鏈球菌均有抑制作用(P＜0.05)。L.casei Shirota，L.casei LC01，L.plantarum ST-Ⅲ， L.paracasei Lpc-37能夠顯著減少生物膜中鏈球菌和MS的數(shù)目(P＜0.05)，同時自身的粘附量未見顯著增加(P＞0.05)。
　　[結(jié)論]
　　五種LB菌株（L.casei Shi