光動力療法對口腔生物膜致齲變形鏈球菌抑制作用的研究.pdf

1、齲病是危害人類健康的第三類疾病，它對健康的危害僅次于心血管疾病和腫瘤。變形鏈球菌等致齲微生物在口腔生物膜內(nèi)形成牙菌斑，并進(jìn)行產(chǎn)酸代謝活動是產(chǎn)生齲病的直接原因。因此，通過適當(dāng)方法影響口腔生物膜內(nèi)的細(xì)菌代謝，干擾牙菌斑的形成或促進(jìn)牙菌斑的解離，即可達(dá)到預(yù)防齲病的目的?，F(xiàn)有防齲方法中氟化物防齲法雖已得到普遍公認(rèn)，但氟化物使用的安全性問題和變形鏈球菌耐氟菌株的出現(xiàn)都為預(yù)防齲病提出了新的課題。尋找更為安全有效的防齲方法是目前急需解決的問題。

2、 光動力療法（Photodynamic Therapy，PDT）目前已成為腫瘤的基本治療手段之一；近年來，在非腫瘤性疾病特別是細(xì)菌性疾病和病毒性疾病的治療上，PDT也取得了顯著的療效。鑒于目前國外已有實(shí)驗(yàn)室開展PDT對單一口腔致齲菌的實(shí)驗(yàn)研究，但未見在人工齲模型上的實(shí)驗(yàn)研究，本研究從齲病預(yù)防的角度出發(fā)，探討PDT對人工齲口腔生物膜致齲變形鏈球菌的作用。 目的： 構(gòu)建符合人體生理環(huán)境的人工齲模型，并將其應(yīng)用于PDT防齲實(shí)

3、驗(yàn)；探討PDT對口腔生物膜中主要致齲菌（變形鏈球菌）的作用；分析PDT過程中不同劑量的光敏劑對抑菌效果的影響，通過實(shí)驗(yàn)選擇適宜預(yù)防齲病的激光能量劑量；結(jié)合DiO、Hoechest33342兩種熒光探針在細(xì)胞水平上探討PDT的防齲機(jī)制；為PDT防齲的臨床實(shí)踐提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.選用變形鏈球菌在體外構(gòu)建符合人體生理環(huán)境的人工齲模型，并對人工齲模型中口腔生物膜生長曲線進(jìn)行測定和釉質(zhì)塊表面顯微硬度進(jìn)行測試。

4、 2.PDT防齲劑量的選擇：應(yīng)用不同能量劑量635nm的半導(dǎo)體激光和血卟啉單甲醚（HMME）作用于人工齲，觀察PDT過程中不同能量劑量對抑菌效果的影響。 3.通過HMME-PDT對細(xì)菌生長的抑制、對細(xì)菌產(chǎn)酸的抑制，觀察PDT對細(xì)菌代謝的影響。 4.通過顯微硬度分析和原子吸收光譜分析PDT對牙齒表面硬度和鈣含量的影響。 5.通過熒光顯微鏡結(jié)合DiO、Hoechest33342兩種熒光探針，探討PDT在細(xì)胞水平的防齲

5、機(jī)制。 結(jié)果： 1.口腔細(xì)菌生物膜在48 h生長達(dá)到了成熟期。致齲處理后，人工齲組牙釉質(zhì)表面的顯微硬度值（MHV）顯著低于對照組（P<0.05）。 2.當(dāng)半導(dǎo)體激光能量劑量為12.47 J/c㎡時，人工齲模型中變形鏈球菌的生長受到顯著抑制（P<0.05）。當(dāng)光敏劑HMME劑量適中（20μg/ml）時，PDT才能有效發(fā)揮對人工齲口腔生物膜中變形鏈球菌的殺菌效應(yīng)（P<0.05）。 3.PDT防齲處理后，人工齲

6、口腔生物膜中變形鏈球菌數(shù)量（CFU/ml）顯著減少（P<0.05），殺菌率高達(dá)99.36%；變形鏈球菌產(chǎn)酸能力顯著下降（P<0.05）。 4.PDT防齲處理后各實(shí)驗(yàn)組MHV由大到小順序?yàn)椋簡渭兗す庹丈?PDT防齲處理>單純HMME>0.05%洗必泰>0.9%生理鹽水；各實(shí)驗(yàn)組鈣溶出濃度由小到大順序?yàn)椋簡渭兗す庹丈? PDT防齲處理<0.05%洗必泰<單純HMME<0.9%生理鹽水。各實(shí)驗(yàn)組間比較具有顯著性差異（P<0.05）。

7、 5.在HMME-PDT防齲過程中，HMME可選擇性與致齲變形鏈球菌結(jié)合，菌體表面呈現(xiàn)紅色熒光；同一視野下，當(dāng)加入細(xì)胞膜綠色熒光探針DiO時，菌體表面呈現(xiàn)綠色熒光；當(dāng)同時還加入Hoechest33342時，雖然基底可見蘭色熒光，但未見Hoechest33342與變形鏈球菌結(jié)合。 結(jié)論： 采用本研究方法形成的人工齲模型已具備牙釉質(zhì)早期齲的表現(xiàn)，可用于PDT防齲的實(shí)驗(yàn)研究。通過實(shí)驗(yàn)選定的HMME-PDT防齲劑量為：HM

8、ME劑量為20μg/ml，半導(dǎo)體激光照光劑量為10mW，90s，12.74J/c㎡。PDT可有效殺滅人工齲口腔生物膜中的變形鏈球菌，并抑制變形鏈球菌的產(chǎn)酸能力。PDT防齲可減少牙齒鈣溶出量，進(jìn)而顯著提高牙齒表面硬度，有利于減慢或阻止齲病的進(jìn)程。HMME-PDT在防齲過程中的作用靶點(diǎn)位于變形鏈球菌細(xì)胞膜上，激光照射時產(chǎn)生的單態(tài)氧和其它活性氧物質(zhì)（ROS）直接損傷細(xì)菌細(xì)胞膜系統(tǒng)，影響其新陳代謝，導(dǎo)致細(xì)菌死亡，從而取得防齲效果。HMME-PD