E3連接酶APC-CCdh1介導(dǎo)BRSK2通過泛素-蛋白酶體途徑進(jìn)行周期性降解.pdf

1、BRSK1(SADB)和BRSK2 SADA)是AMPK家族中兩個同源基因，在腦，睪丸和胰腺中特異表達(dá)。有研究表明，BRSK1能磷酸化周期蛋白Wee1，Cdc25B和Cdc25C，從而調(diào)節(jié)Cdk1活性，最終抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。有文獻(xiàn)報(bào)道BRSK2同樣也能磷酸化Wee1蛋白。最新的研究發(fā)現(xiàn)，BRSK1能磷酸化γ-tubulin的Ser131，并認(rèn)為BRSK1對Cdc25C的磷酸化調(diào)節(jié)是由細(xì)胞周期進(jìn)程中BRSK1的活性變化調(diào)控的。而本文研究提

2、出一個新的觀點(diǎn)，BRSK2能通過蛋白水平的變化機(jī)制來調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程。
　　細(xì)胞要順利通過細(xì)胞周期的各個進(jìn)程需要非常復(fù)雜的信號通路的調(diào)控，包括各種調(diào)節(jié)因子的磷酸化和泛素化介導(dǎo)的蛋白降解事件的有序完成。細(xì)胞有絲分裂的有序進(jìn)程需要有后期促進(jìn)復(fù)合物/周期體（anaphase-promotingcomplex/cyclosome，APC/C）的調(diào)節(jié)，APC/C介導(dǎo)底物的降解需要共激活子Cdh1和Cdc20的激活作用，大部分被識別并降解的

3、底物中都有降解子Dbox和/或KENbox的存在。
　　通過亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源BRSK2蛋白在有絲分裂期與γ-tubulin共定位。細(xì)胞阻滯和釋放實(shí)驗(yàn)后都發(fā)現(xiàn)，BRSK2蛋白水平在G2/M期達(dá)到頂峰，G2/M期后逐漸下降，到G1/S又降至最低，結(jié)果表明BRSK2蛋白在細(xì)胞有絲分裂過程中是不穩(wěn)定的。細(xì)胞經(jīng)蛋白酶體抑制劑處理后，BRSK2的蛋白水平顯著上調(diào)，而BRSK2的mRNA水平并沒有明顯的變化。實(shí)驗(yàn)還證明，BRSK2能夠被

4、泛素化，且用MG132處理后，泛素化水平顯著增強(qiáng)。研究表明，不是APC/CCdc20，而是APC/CCdh1介導(dǎo)促進(jìn)BRSK2蛋白的泛素化降解。干擾內(nèi)源Cdh1后，引起B(yǎng)RSK2的蛋白水平上調(diào)。用放線菌酮處理細(xì)胞后，干擾內(nèi)源Cdh1組的BRSK2蛋白半衰期比非干擾的對照組中的顯著延長。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，在生理?xiàng)l件下，BRSK2與Cdh1相互作用，且在有絲分裂期亞細(xì)胞共定位，表明內(nèi)源BRSK2與Cdh1在有絲分裂期形成復(fù)合體。經(jīng)篩查發(fā)現(xiàn)，B

5、RSK2蛋白氨基序列中含有2個典型的D box和1個KEN box，通過物種間同源比對發(fā)現(xiàn)，這3個box是非常保守的。實(shí)驗(yàn)鑒定BRSK2蛋白的降解是KEN box依賴的，而KEN box的突變增強(qiáng)了BRSK2蛋白的穩(wěn)定性。超表達(dá)野生型BRSK2和KEN box突變體均能引起細(xì)胞G2/M期細(xì)胞增多。因此，我們首次發(fā)現(xiàn)并證明BRSK2通過泛素-蛋白酶體途徑來調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程。
　　本文的第二部分還初步研究了新基因C19orf66的生

6、物學(xué)功能。C19orf66蛋白屬于UPF0515蛋白家族，資料顯示，C19orf66基因在進(jìn)化歷史進(jìn)程中，到半脊索海生生物Saccoglossus kowalevskii時開始出現(xiàn)。迄今為止，對于C19orf66的功能研究仍然很有限。有基因芯片數(shù)據(jù)顯示，C19orf66在腦癌，肺癌等多種腫瘤組織中下調(diào)表達(dá)。根據(jù)已有的信息提示，我們開始對C19orf66進(jìn)行初步的功能研究。C19orf66基因位于19號染色體上，基因全長2139bp，其開

7、放閱讀框（ORF）編碼291個氨基酸。C19orf66基因定位在19p13.2，由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成。對同源基因進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，C19orf66基因在脊椎動物中有很高的同源性。RT-PCR分析顯示，C19orf66在人的不同組織中均有表達(dá)。在HeLa細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位分析表明，C19orf66主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。通過信號通路研究發(fā)現(xiàn)，C19orf66顯著下調(diào)Rb通路的活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)和消減C19orf66均可促進(jìn)腫瘤