宿主細(xì)胞F-actin聚集與雞球蟲(chóng)入侵關(guān)系研究.pdf

1、雞球蟲(chóng)病是由多種艾美耳球蟲(chóng)寄生于雞的腸上皮細(xì)胞內(nèi)所引起的一種寄生性原蟲(chóng)病。雞球蟲(chóng)種類不同，寄生部位和致病性亦有差異，其中柔嫩艾美耳球蟲(chóng)是致病性最強(qiáng)、危害最為嚴(yán)重的一種。近年來(lái)隱孢子蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)和瘧原蟲(chóng)在入侵機(jī)制的研究方面發(fā)展迅速，研究發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體入侵會(huì)引起宿主細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的變化。而雞球蟲(chóng)也是頂復(fù)門原蟲(chóng)，其入侵機(jī)制是否相似？為了探討這一問(wèn)題，本試驗(yàn)以HCT-8傳代細(xì)胞建立體外培養(yǎng)模型，對(duì)雞球蟲(chóng)入侵該細(xì)胞的規(guī)律、球蟲(chóng)接種劑量、培養(yǎng)基類型、血清濃度

2、、pH等培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化；在此基礎(chǔ)上，探索了宿主細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子入侵的影響。
　　1.柔嫩艾美耳球蟲(chóng)HCT-8細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立。通過(guò)在24孔細(xì)胞板上接種一定數(shù)量子孢子后不同時(shí)間取樣，采用HE染色后在顯微鏡下觀察球蟲(chóng)入侵該細(xì)胞后的發(fā)育情況。結(jié)果顯示球蟲(chóng)子孢子入侵HCT-8細(xì)胞后可以發(fā)育到第2代裂殖子階段，表明建立的模型可以用于球蟲(chóng)入侵階段的研究。
　　2.柔嫩艾美耳球蟲(chóng)對(duì)HCT-8細(xì)胞入侵條件的優(yōu)化。以

3、Real-time RT PCR方法評(píng)價(jià)子孢子最佳入侵時(shí)間、最適接種劑量、培養(yǎng)基種類、pH值及血清濃度對(duì)雞球蟲(chóng)子孢子入侵率的影響。結(jié)果顯示，雞球蟲(chóng)在體外培養(yǎng)條件下，最佳入侵時(shí)間為6h，子孢子接種劑量為3×105個(gè)/孔時(shí)入侵達(dá)到飽和，當(dāng)培養(yǎng)基為RPMI1640且pH值為6.5時(shí)子孢子入侵率最高，血清濃度為1％時(shí)最有利于子孢子入侵。試驗(yàn)優(yōu)化了雞球蟲(chóng)入侵HCT-8細(xì)胞的條件，為雞球蟲(chóng)入侵機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　3.雞球蟲(chóng)入侵與宿主細(xì)

4、胞骨架結(jié)構(gòu)的關(guān)系。先將一定數(shù)量的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子接種到HCT-8細(xì)胞，入侵一定時(shí)間后取樣，對(duì)樣品細(xì)胞內(nèi)F-actin(肌動(dòng)蛋白)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。用不同濃度的細(xì)胞松弛素D抑制宿主細(xì)胞F-actin聚集，免疫熒光染色同時(shí)以Real-time RT PCR方法評(píng)價(jià)子孢子對(duì)HCT-8細(xì)胞的入侵率。結(jié)果顯示球蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中，宿主細(xì)胞F-actin特異性聚集在球蟲(chóng)子孢子表面。球蟲(chóng)入侵率隨著該藥物濃度增加而下降，當(dāng)濃度達(dá)到50μg/mL時(shí)入