與Coronin3相互作用的F-actin核化相關(guān)分子Arp2調(diào)控胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、【背景】:
　　胃癌是常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在所有腫瘤中居第四位,死亡率居第二位,嚴重威脅著人類的健康。胃癌患者的預后較差,5年生存率較低。由于早期胃癌的癥狀不明顯,患者就診時胃癌常進入中晚期,且伴隨著淋巴結(jié)或遠處器官的轉(zhuǎn)移。這是胃癌患者治療失敗和死亡的重要原因之一。因此,尋找與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵分子對提高胃癌的治療效果尤為重要。
　　本研究所前期利用雜交瘤技術(shù)篩選出一系列特異性較高的胃癌相關(guān)單克隆抗體,其中MGb2-

2、Ag與胃癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過免疫共沉淀和質(zhì)譜分析我們發(fā)現(xiàn)Coronin家族成員Coronin3是與MGb2-Ag相互作用的分子。Coronin家族成員參與了細胞骨架的重組、細胞偽足的形成和細胞運動;肌動蛋白細胞骨架存在兩種形式,即球肌動蛋白(G-actin)和絲狀肌動蛋白(F-actin)。其中F-actin核化又是細胞骨架重組的重要步驟,核化即幾個蛋白單體先組裝成多聚體,然后其他單體繼續(xù)添加形成長纖維分子。由此我們推測,Coroni

3、n3可能通過影響腫瘤細胞F-actin核化進而影響腫瘤細胞侵襲性偽足形成,從而促進胃癌細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　本研究通過免疫沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)F-actin核化相關(guān)蛋白Arp2是與Coronin3發(fā)生相互作用的分子。我們進一步發(fā)現(xiàn)Arp2在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達明顯高于原發(fā)灶,其在高轉(zhuǎn)移潛能的胃癌細胞亞系MKN28-M中的表達水平亦顯著高于低轉(zhuǎn)移潛能的細胞亞系MKN28-NM及其親本細胞MKN28。通過功能獲得性和缺失性研究,我們

4、證實了Arp2能夠在體外顯著促進胃癌細胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究有助于深入闡明細胞骨架調(diào)節(jié)蛋白參與腫瘤轉(zhuǎn)移的機制,為有效干預胃癌轉(zhuǎn)移提供新的治療策略。
　　【目的】:
　　1、研究Coronin3在胃癌組織中的表達及與預后的關(guān)系;
　　2、篩選可與Coronin3相互作用的F-actin核化相關(guān)分子;
　　3、研究目標分子在胃癌組織中的表達及其與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系;
　　4、研究目標分子對胃癌侵襲

5、轉(zhuǎn)移能力的調(diào)節(jié)作用;
　　【方法】:
　　1.免疫組織化學檢測Coronin3在胃癌和匹配癌旁組織中的表達情況并分析其表達與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系;利用Kaplan-Meier方法繪制出生存曲線并分析Coronin3與胃癌患者預后的關(guān)系;
　　2.采用免疫沉淀技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學分析篩選與Coronin3相互作用的F-actin核化分子,并通過免疫沉淀驗證;
　　3.采用免疫

6、組織化學檢測其在胃癌中的表達情況;分析目標分子的表達強度與患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系;利用Kaplan-Meier方法繪制出生存曲線并分析其與胃癌患者預后的關(guān)系;
　　4.采用westernblot和qPCR檢測目標分子在各胃癌細胞系中的表達;構(gòu)建目標分子的過表達質(zhì)粒及siRNA,對低表達和高表達目標分子的胃癌細胞系分別進行瞬時轉(zhuǎn)染,通過細胞劃痕、Transwell侵襲實驗等研究其在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　【結(jié)果】:

7、>　　1.Coronin3在癌旁組織中的陽性率為50.7％(38/75),在胃癌中的陽性率為68%(51/75);Coronin3與胃癌患者的性別和年齡無關(guān),但與胃癌的分化程度及TNM分期存在密切的相關(guān)性,且分化程度越低,TNM分期越高,其在胃癌中的表達越強;Coronin3的表達還與患者的生存時間具有相關(guān)性,Coronin3高表達的胃癌患者生存時間相對較短。
　　2.選擇胃癌高轉(zhuǎn)移細胞系MKN28-M進行免疫沉淀,再經(jīng)質(zhì)譜及生物

8、信息學分析獲得了與Coronin3相互作用的分子——肌動蛋白相關(guān)蛋白2(Actin-relatedprotein2,Arp2),匹配序列為GYAFNHSADFETVR。免疫沉淀技術(shù)檢測提示這兩個分子間存在相互作用關(guān)系。
　　3.Arp2在胃癌中的陽性率為62.7%(47/75),在癌旁組織中的陽性率為21.3%(16/75);其在原發(fā)灶的陽性率為52.5%(21/40),在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的陽性率為82.5%(33/40);Arp2的

9、表達與性別和年齡無關(guān),但與胃癌的分化程度及TNM分期存在密切的關(guān)系,并且分化程度越低,TNM分期越高,其在胃癌中的表達越強;隨著Arp2表達的增強,胃癌患者的生存時間逐漸縮短。
　　4.Westernblot及qPCR實驗結(jié)果均顯示Arp2在胃癌高轉(zhuǎn)移細胞系MKN28-M中的表達高于親本細胞MKN28及低轉(zhuǎn)移細胞系MKN28-NM,而在人永生化胃粘膜上皮細胞GES中呈低表達。下調(diào)MKN28-M中Arp2的表達可抑制細胞的體外遷移和

10、侵襲能力;上調(diào)MKN28-NM中的Arp2則促進胃癌細胞發(fā)生遷移和侵襲。
　　【結(jié)論】:
　　本研究發(fā)現(xiàn)Coronin3與胃癌患者的預后密切相關(guān)。通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)發(fā)現(xiàn)并驗證了Arp2是與Coronin3相互作用的F-actin核化分子,其表達與胃癌的分化和TNM分期相關(guān),在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的陽性率高于原發(fā)灶。此外,Arp2還與胃癌患者的生存期相關(guān),表達越高,生存期越短。Arp2在胃癌高轉(zhuǎn)移細胞系MKN28-M中表達高于親本細