人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在寡含血小板血漿膠體內(nèi)的分泌活動研究.pdf

1、目的：
　　1.研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，HUCMSCs）與寡含血小板血漿(platelet poor plasma,PPP)體外形成膠體的條件以及膠體的性質(zhì)；
　　2.將HUCMSCs血漿膠體進(jìn)行體外培養(yǎng)，從膠體的形態(tài)、成分結(jié)構(gòu)和HUCMSCs生物活性上評估其在軟組織填充中的作用。
　　方法：
　　1、從健康孕婦的剖宮產(chǎn)術(shù)中獲取

2、臍帶，分離出華通膠，用手術(shù)刀切成2mm大小塊，在培養(yǎng)皿貼壁后加入10％FBS DMEM/F12培養(yǎng)基，1%青霉素-鏈霉素和重組牛堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF,珠海億勝），在細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行原代培養(yǎng)1周。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。待原代HUCMSCs達(dá)到80%融合時(shí)，按照一定比例進(jìn)行擴(kuò)增。第3代HUCMSCs達(dá)到80%以上融合時(shí)，收集細(xì)胞與PPP混勻后形成細(xì)胞-血漿混合

3、物，最終細(xì)胞濃度5×105/mL作為標(biāo)準(zhǔn)濃度。在六孔板內(nèi)，吸取細(xì)胞-血漿混合物與10%葡萄糖酸鈣以不同體積進(jìn)行混勻，總體積1ml。在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育相同時(shí)間，記錄成膠情況。2、實(shí)驗(yàn)組中將HUCMSCs與1ml PPP成膠后進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)后的第1,3,7,14天收集膠體1ml上清液。對照組膠體中沒有加入HUCMSCs，只收集第1天上清液最為起始參考值，同時(shí)增加二維單層培養(yǎng)的融合度50%的HUCMSCs作為對照。當(dāng)收集完畢后，對上清

4、液進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。將檢測的細(xì)胞生長因子包括胰島素樣生長因子（IGF-I）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-α1和TGF-β1）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）。同時(shí)膠體在培養(yǎng)后第1周、2周和4周，用4%的多聚甲醛固定，包埋制成石蠟切片，用HE和透明質(zhì)酸染色檢測膠體活性情況。
　　結(jié)果：
　　1、HUCMSCs與PPP混合物在體外37℃，通過10%葡萄糖酸鈣作用凝成膠體，成膠程度與10%葡萄糖酸鈣體積比相關(guān)

5、，其中最佳比例為混合物：10%葡萄糖酸鈣=7:1。所形成的膠體是柔軟、半固體和可注射的，在不添加培養(yǎng)基前提下可在培養(yǎng)箱內(nèi)穩(wěn)定維持3個月以上。2、體外培養(yǎng)不同時(shí)間段，將膠體標(biāo)本固定、石蠟包埋、切片，通過HE染色、透明質(zhì)酸染色和ELISA檢測上清液中多種細(xì)胞生長因子，表明HUCMSCs在膠體支架內(nèi)三維環(huán)境生長，能合成分泌透明質(zhì)酸和分泌多種促進(jìn)組織修復(fù)再生的細(xì)胞生長因子。
　　結(jié)論：
　　HUCMSCs和PPP可形成一種可塑性較好