氟暴露致體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞損傷機(jī)理的研究.pdf

1、氟廣泛分布于自然界，是一種人體必需的微量元素，但長(zhǎng)期過(guò)量攝入，可在體內(nèi)蓄積，引起地方性氟中毒，嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體的骨相和非骨相器官。其損傷可能與氟引發(fā)的氧化應(yīng)激有關(guān)，但具體機(jī)制仍不明了。細(xì)胞凋亡或許是其中的關(guān)鍵一環(huán)。近年來(lái)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所引起的細(xì)胞凋亡，已經(jīng)成為人們研究氟致機(jī)體損傷的熱點(diǎn)。然而其側(cè)重點(diǎn)多是關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在氟致骨相器官損傷方面的研究，而在非骨相器官上研究較少，并且傳統(tǒng)的氧化應(yīng)激檢測(cè)指標(biāo)如SOD、MDA等，由于其測(cè)定方法受多種因素影

2、響，不僅特異性與敏感性均較低，且所得結(jié)果也互有差異或相互矛盾。本研究采用直接測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS濃度變化的方法，對(duì)進(jìn)一步探討氟致神經(jīng)細(xì)胞損傷作用的分子機(jī)理有十分重要的意義。
　　PC12細(xì)胞來(lái)源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤，可在神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growthfactor，NGF)誘導(dǎo)下增殖和分化為有交感神經(jīng)元特性的細(xì)胞，廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的氟（0.5、1.0、1.5和2.0mM）處理PC12細(xì)胞

3、，在不同的時(shí)間段(2、4、6、8、12、24和48h)用cck-8染色檢測(cè)細(xì)胞活性;氟暴露2h后，用DCF標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平;氟暴露8h后，用Rhodamine123和JC-1染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化，用Hoechst-33342檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀況;氟暴露24h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，應(yīng)用western blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白PARP、p-eIF和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白XBP-1表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果如

4、下:
　　1.細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果:與對(duì)照組相比，染氟2h后，2.0mM組細(xì)胞存活率顯著下降（P＜0.05）;染氟4h后，1.5和2.0mM組細(xì)胞存活率顯著或極顯著降低(P＜0.05或P＜0.01);氟暴露8h及48h后，各組細(xì)胞存活率極顯著降低(P＜0.01);染氟12h后1.0和1.5mM組細(xì)胞存活率顯著下降(P＜0.05），2.0mM組細(xì)胞存活率極顯著降低(P＜0.01);氟暴露24h后，0.5和1.0mM組細(xì)胞存活率顯著降低(

5、P＜0.05)，1.5和2.0mM組，細(xì)胞存活率極顯著降低(P＜0.01）。
　　2.細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果:正常細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，有2到多個(gè)突起，染氟24h后，隨著染氟濃度的增加，細(xì)胞密度逐漸降低，部分細(xì)胞開始變圓，凋亡/死亡細(xì)胞數(shù)量增多，甚至可以看到明顯的凋亡小泡和細(xì)胞碎片。
　　3.細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測(cè)結(jié)果:細(xì)胞暴露于NaF2h后，隨著染氟濃度增加，細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度逐漸升高.與對(duì)照組相比，1.5mM組和2.0mM活性氧濃度均極顯

6、著升高(P＜0.01)。
　　4.線粒體膜電位變化結(jié)果:細(xì)胞暴露于NaF8h后，隨著染氟濃度增加，Rho-123標(biāo)記的細(xì)胞熒光強(qiáng)度基本呈增強(qiáng)趨勢(shì)，顯示細(xì)胞線粒體膜電位逐漸降低，與對(duì)照組相比，2.0mM組細(xì)胞線粒體膜電位極顯著降低(P＜0.01); JC-1標(biāo)記的細(xì)胞其熒光逐漸由紅轉(zhuǎn)綠，說(shuō)明線粒體膜去極化逐漸加劇，即線粒體膜電位不斷降低，表明細(xì)胞凋亡發(fā)生。
　　5.細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果:正常細(xì)胞核為長(zhǎng)圓形或卵圓形，細(xì)胞發(fā)生凋亡后，

7、細(xì)胞核變圓，核固縮，染色加深，熒光強(qiáng)度增加。與對(duì)照組相比，各組熒光強(qiáng)度變化無(wú)顯著差異(P＞0.05)，除0.5mM組外，略有升高趨勢(shì)，表明發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)量也略有增多。
　　6.Western blot分析結(jié)果:與對(duì)照組相比，1.0mM組XBP-1和PARP蛋白表達(dá)水平均顯著上升(P＜0.05)，而PARP剪切帶即PARP'蛋白表達(dá)水平極顯著上升(P＜0.01)，其余各濃度、各蛋白表達(dá)水平略有浮動(dòng)，但無(wú)顯著差異(P＞0.05）。表

8、明PARP可能是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，XBP-1則可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白之一。
　　結(jié)論:氟暴露可導(dǎo)致細(xì)胞活性降低，與染氟時(shí)間呈負(fù)相關(guān)性，與染氟劑量也基本上成負(fù)相關(guān)性;在一定的氟暴露時(shí)間段內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、細(xì)胞線粒體膜的損傷程度和細(xì)胞的凋亡水平基本與氟暴露水平成線性關(guān)系，提示氟暴露致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激是氟誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的原因之一，XBP-1則可能是氟致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白之一，這些研究結(jié)果再