單管二重一步法RT-PCR鑒別診斷腸道病毒71型(EV71)和非EV71手足口病.pdf

1、手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)是由腸道病毒引起的急性傳染病，主要發(fā)生于5歲以下兒童，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱和手、足、口腔等部位皮膚或粘膜紅色丘疹或皰疹。引起手足口病的腸道病毒有多種，包括柯薩奇病毒A組的16(CA16)、4、6、10、12，B組的2、3、5，埃可病毒4、19、30，以及腸道病毒71型(EV71)等，其中以EV71和CA16最為常見。通常情況下，EV71和CA16等非EV71腸道病毒感

2、染引起的手足口病在臨床癥狀和體征方面難以區(qū)別，但EV71手足口病中部分患者會(huì)出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹和神經(jīng)源性肺水腫等多種神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，病情兇險(xiǎn)，嚴(yán)重危害嬰幼兒的生命健康。近年來，我國及周邊地區(qū)手足口病疫情日趨嚴(yán)重。2011年我國全年累計(jì)報(bào)告病例161萬余例，死亡509例。因此早期、快速、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷，特別是鑒別EV71型和非EV71型手足口病，對(duì)于積極的臨床救治和疫情防控具有重要意義。
　　RT-PCR檢測

3、技術(shù)因有快速、敏感、特異的特點(diǎn)，已成為手足口病病原體快速診斷的重要手段，但目前建立的方法主要針對(duì)EV71和CA16，不僅造成其它非EV71病原體的漏診，而且EV71和CA16要分別PCR擴(kuò)增，繁瑣費(fèi)時(shí)，試劑消耗大，操作步驟多，容易造成實(shí)驗(yàn)失敗。如能建立一種EV71和非EV71的二重RT-PCR，在一個(gè)擴(kuò)增管中同時(shí)擴(kuò)增EV71和非EV71，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的不同鑒別EV71型和非EV71型手足口病。這種單管二重一步法RT-PCR必將具有廣泛的

4、應(yīng)用前景。
　　本研究從Genbank下載了腸道病毒所有67個(gè)血清型的216個(gè)基因序列，設(shè)計(jì)腸道病毒通用引物與EV71特異性引物，并從不同的引物組合中篩選出最優(yōu)二重引物。利用該引物建立的單管二重一步法RT-PCR，對(duì)EV71的檢測下限為0.001 TCID50/mL，對(duì)非EV71腸道病毒檢測下限為0.01 TCID50/mL；對(duì)不同手足口病病原體進(jìn)行二重RT-PCR，所有的EV71毒株都能擴(kuò)增出兩條目的條帶，分別為889bp和30

5、6bp，而對(duì)非EV71腸道病毒均只擴(kuò)增出一條306p的目的條帶。檢測165份來源于手足口病患兒咽拭子標(biāo)本，RT-PCR陽性有113份，陽性率達(dá)68.5％，其中EV71陽性標(biāo)本76份，非EV71腸道病毒陽性標(biāo)本37份。在所有重癥手足口病中，約85%的病原體為EV71。同時(shí)RT-PCR檢出率在發(fā)病一周后開始下降。隨機(jī)測序49份EV71 RT-PCR陽性產(chǎn)物VP1基因序列，均為EV71；通過MEGAv5.03軟件構(gòu)建基于VP1基因序列的基因進(jìn)