人原始生殖細胞體外培養(yǎng)的初步研究.pdf

1、目的:1.確定人原始生殖嵴/腺的大體解剖位置以獲取人PGCs;2.為探討人PGCs的體外培養(yǎng)條件,初步建立PGC體外培養(yǎng)體系,為建立EG細胞系打下基礎(chǔ).3.從形態(tài)學(xué),表面標(biāo)記和體外分化等方面初步鑒定人PGCs的生物學(xué)特性.材料和方法:1.取胎齡分別為7,9,11,13周的完整人胚行原始生殖嵴/腺快速壓片,將單層細胞進行堿性磷酸酶(AKP)染色以確定PGCs大體解剖位置;2.比較不同培養(yǎng)體系對PGCs生長的影響.分別以鼠胚成纖維細胞(ME

2、F),人胚成纖維細胞(HEF)和STO小鼠細胞制備飼養(yǎng)層細胞,觀察飼養(yǎng)層細胞生長行為及特性.隨機收集胎齡在6-14周的人胚50枚,根據(jù)大體解剖位置分離PGCs,觀察PGC和PGCs集落形態(tài)學(xué)和生長特性,并在四組不同的培養(yǎng)體系內(nèi)進行PGCs的體外培養(yǎng),擴增和傳代:第一組:無飼養(yǎng)無細胞因子組,第二組:飼養(yǎng)層無細胞因子組,第三組:細胞因子無飼養(yǎng)層組,第四組:飼養(yǎng)層+細胞因子組.探討飼養(yǎng)層和細胞因子對人PGCs體外培養(yǎng)的影響;比較不同發(fā)育時期人

3、胚平均PGCs原代集落形成數(shù);3.從細胞表面標(biāo)記(AKP,SSEA-1,SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81)和體外分化實驗等方面鑒定人PGCs的生物學(xué)特性.結(jié)論:1.確定早期人胚原始生殖嵴/腺的大體解剖位置;2.8-9周的人胚是獲取人PGCs進行體外培養(yǎng)研究的較好材料;3.PGCs體外培養(yǎng)是飼養(yǎng)層和細胞因子依賴的,其中以MEF和STO為飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系內(nèi)PGCs的生長狀態(tài)較好;4.從細胞形態(tài),表面標(biāo)記,體外分