柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫的構建及鈣依賴蛋白激酶3相互作用蛋白的篩選.pdf

1、近年來，由于抗球蟲藥的大量使用，球蟲耐藥性的產生給球蟲病的防治帶來極大的挑戰(zhàn)，球蟲疫苗的研究以及新的藥物靶標的篩選已迫在眉睫。鈣依賴蛋白激酶(Calcium dependent proteinkinases，CDPKs)作為多基因編碼的大家族中的成員，通過Ca2+信號通路向下游傳遞磷酸化信號而產生級聯(lián)放大效應，從而使相關蛋白發(fā)揮功能。本實驗室前期對EtCDPK3基因特性進行了研究，結果表明EtCDPK3蛋白在球蟲子孢子階段高表達，在蟲體

2、入侵和逸出宿主細胞過程中發(fā)揮一定的作用。為了篩選EtCDPK3的作用底物，本研究構建了柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫，以EtCDPK3為誘餌構建重組質粒pGBKT7-EtCDPK3，對子孢子cDNA文庫進行篩選，并對篩選陽性克隆的EST序列進行Blast比對和生物信息學分析，隨機挑選三個陽性克隆EST序列，對其進行基因克隆、構建真核重組質粒以及與EtCDPK3相互作用關系的驗證。
　　1.柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交

3、cDNA文庫的構建
　　提取純化的柔嫩艾美耳球蟲子孢子總RNA，經MMLV-RT反轉錄合成cDNA第一鏈后，利用LD-PCR擴增合成雙鏈cDNA(ds cDNA)，dscDNA經純化柱CHROMA SPINT+TE-400Columns純化剔除小于200 bp的片段。將純化后ds cDNA、pGADT7-Rec及CarrierDNA共轉化到酵母感受態(tài)細胞Y187中，dscDNA與pGADT7-Rec以同源重組的方式在細胞內進行連接

4、，經過缺陷性培養(yǎng)基(SD/-Leu)篩選得到子孢子酵母雙雜交cDNA文庫。結果顯示，構建的柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫的轉化率為4.33×105/μg pGADT7-Rec，文庫滴度為3.62×107 cfu/mL，隨機挑取32個單克隆進行PCR檢測，插入片段的大小在200 bp～2000 bp之間，重組率為93.75％，并以該文庫作為模板，用柔嫩艾美耳球蟲5對特異性引物進行PCR擴增，獲得了這5個基因片段。結果表明成功構

5、建了柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫，為進一步篩選和研究球蟲入侵互作蛋白奠定了基礎。
　　2.誘餌重組質粒pGBKT7-EtCDPK3的構建及互作蛋白的篩選
　　根據GeneBank上EtCDPK3的基因序列設計引物，克隆獲得了含EtCDPK3ORF的基因片段。用限制性內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ對EtCDPK3和pGBKT7空質粒進行雙酶切，將回收的雙酶切產物連接轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞(TOP10)，經測序及雙酶

6、切驗證，成功構建了誘餌重組質粒pGBKT7-EtCDPK3。將其轉化到Y2HGold酵母感受態(tài)細胞中，并對該菌株的自轉錄活性、細胞毒性以及蛋白的表達進行了鑒定，結果表明含有誘餌重組質粒的Y2HGold酵母菌株沒有自激活活性，誘餌質粒對酵母細胞不存在細胞毒性，而且誘餌質粒pGBKT7-EtCDPK3可以在酵母細胞中成功表達，因此，構建的誘餌重組質?？捎糜诤Y選柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫。將轉化誘餌質粒pGBKT7-EtCDP

7、K3的Y2HGold誘餌菌株與構建的子孢子酵母雙雜交cDNA文庫進行雙雜交，融合好的混懸液均勻涂布在高度缺陷性固體培養(yǎng)基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp）上，再將平板上的單克隆轉移到含SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/Aba固體培養(yǎng)基進行篩選，重復兩次，生長良好的藍斑克隆即為陽性克隆。陽性克隆經過質粒提取、測序結果分析，去除重復的基因序列，最終篩選到11個陽性質粒。
　　3.EtCDPK3

8、蛋白與陽性克隆蛋白互作的驗證
　　隨機挑取3個陽性質粒（編號:Et12、Et14、Et27）進行回復雜交驗證，發(fā)現(xiàn)在高度缺陷性培養(yǎng)基上有藍色單克隆長出，推測這些陽性質粒與誘餌質粒之間可能存在互作關系。為了進一步驗證它們的關系，我們用PCR技術擴增了3個基因的ORF序列，并成功構建了用于BiFC系統(tǒng)的真核重組表達質粒pBiFC-VC155-Et12、pBiFC-VC155-Et14、pBiFC-VC155-Et27，同時將EtCDP

9、K3連接到pBiFC-VN155載體構建了重組質粒pBiFC-VN155-EtCDPK3，將鑒定正確的3個陽性重組質粒分別與pBiFC-VN155-EtCDPK3共轉染到DF-1細胞中，倒置熒光顯微鏡下觀察，結果顯示除陽性對照有綠色熒光以外，陰性對照和樣品組均沒有綠色熒光存在;同時又構建了真核重組質粒 pcDNA3.1-flag-Et12、 pcDNA3.1-flag-Et14、 pcDNA3.1-flag-Et27與pcDNA3.1-

10、EtCDPK3，間接免疫熒光和Western blot的結果表明重組質粒在DF-1細胞中能夠成功表達。經免疫共沉淀實驗驗證，結果表明Flag標簽單抗可以沉淀Et12、Et14、Et27表達的蛋白，但是不能沉淀EtCDPK3表達的蛋白。上述實驗結果表明，Et12、Et14、Et27與EtCDPK3可能不存在相互作用關系。
　　4.EtCHP12功能特性的初步研究
　　生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，EtCHP12基因的ORF為1656 b

11、p，編碼551個氨基酸，為柔嫩艾美耳球蟲保守未知蛋白，為了進一步驗證EtCHP12的功能，PCR擴增了EtCHP12基因的ORF全長，連接到原核表達載體pET-28a成功構建了原核重組表達質粒pET-28a-EtCHP12，并在大腸桿菌BL21中成功表達，獲得可溶性的重組蛋白。將純化的重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗血清。體外抑制實驗結果表明，純化后的抗rEtCHP12多抗作用子孢子后，與正常兔血清IgG組相比子孢子入侵DF-1細胞