血清4型禽腺病毒GX2013毒株的生物學(xué)特性鑒定和檢測(cè)方法的建立.pdf

1、血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotybe4，F(xiàn)AdV-4)主要引起以3-5周齡肉雞突然死亡并伴隨心包積水和肝炎為特征癥狀的心包積水-肝炎綜合征(Hydropericardiumhepatitis syndrome，HHS)。1987年8月FAdV-4首先報(bào)道發(fā)現(xiàn)于巴基斯坦安加拉地區(qū)，2015年7月首次有文獻(xiàn)確認(rèn)中國(guó)發(fā)生該疾病。血清4型禽腺病毒廣西分離株(FAdV-4GX2013)于2013年分離自廣西某地肉雞場(chǎng)

2、，在臨床上具有較強(qiáng)的致病性。為進(jìn)一步了解FAdV-4 GX2013毒株的生物學(xué)特性，我們對(duì)該毒株致細(xì)胞病變作用、SPF雞胚致病性和對(duì)SPF雛雞的致病情況進(jìn)行了研究，并測(cè)定了全基因組，與其他來(lái)源的禽腺病毒毒株基因組進(jìn)行了分析比較。另外，通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了該毒株的結(jié)構(gòu)蛋白纖絲蛋白Ⅱ（fiberⅡ），建立了特異性檢測(cè)FAdV-C的方法，為FAdV-C感染的診斷和監(jiān)測(cè)提供技術(shù)手段。
　　1、血清4型禽腺病毒GX2013株生物學(xué)特性的鑒

3、定
　　將FAdV-4 GX2013毒株經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種9日齡SPF雞胚后，5d后開(kāi)始出現(xiàn)雞胚死亡。隨后對(duì)死亡和未死亡雞胚進(jìn)行剖檢觀察，可發(fā)現(xiàn)感染FAdV-4 GX2013毒株的雞胚絨毛尿囊膜增厚，雞胚發(fā)育不良;胸肌和腿肌有廣泛性針尖狀出血點(diǎn);雞胚肝臟腫大，出血，邊緣壞死;脾臟腫大，充血發(fā)紅;腎臟腫大，出血，腎小管變性，突起;腺胃水腫，出血;腺胃、肌胃交界處有潰瘍?cè)睢?br>　　為觀察FAdV-4 GX2013毒株對(duì)雞的致病性

4、，將FAdV-4 GX2013毒株經(jīng)滴鼻和頸部皮下注射接種1日齡SPF雞后，7天內(nèi)滴鼻組和頸部皮下攻毒試驗(yàn)組雞死亡率分別是80％和100％。臨床癥狀表現(xiàn)為心包積液，肝臟腫大、伴有多灶性壞死的病變，肌胃粘膜固有層潰瘍，腎臟腫大。
　　為研究FAdV-4 GX2013毒株在細(xì)胞上的病變情況，將其分別感染DF-1、Vero、293T、CEF、CEL、LMH細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)該毒株在CEF、DF-1、293T和Vero細(xì)胞上不增殖，但可以在CE

5、L、LMH細(xì)胞上增殖并引起病變。
　　合成引物成功擴(kuò)增GX2013毒株全基因組序列，并進(jìn)行序列的測(cè)定與分析。結(jié)果表明FAdV-4 GX2013株全基因組大小為43752bp，基因組的特點(diǎn)與近期國(guó)內(nèi)血清4型禽腺病毒分離株HB1510株并無(wú)區(qū)別。
　　2、禽腺病毒間接ELISA檢測(cè)方法的建立
　　本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增了FiberⅡ基因并克隆到pET-32a(+)表達(dá)載體，將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)