人細(xì)小病毒B19-XA2株VP1蛋白Bac-to-Bac系統(tǒng)表達(dá)及免疫學(xué)特性分析.pdf

1、人細(xì)小病毒B19（HumanparvovirusB19，又稱人微小病毒B19，簡(jiǎn)稱B19病毒）是迄今發(fā)現(xiàn)的能感染人類的最小的單鏈線狀DNA病毒之一。自1990年我們?cè)趪?guó)內(nèi)首次證實(shí)我國(guó)存在B19病毒感染以來(lái)，越來(lái)越多的研究揭示我國(guó)B19病毒感染可誘發(fā)急性再障危象、急性血小板減少性紫癜及孕婦非免疫性流產(chǎn)等疾病，尤其對(duì)于免疫功能低下或缺陷患者，因缺乏有效治療藥物，B19病毒持續(xù)感染可致慢性貧血，甚至危及生命。因此，在我國(guó)乃至世界都需要建立有效

2、的B19病毒防治體系。
　　B19病毒基因存在較大的變異。目前B19病毒分為三種基因型：1型(原型)、2型(類A6-和LaLi-)、3型(V9)。不同基因型的分布存在著地理的差異。歐美等西方國(guó)家流行的病毒株大多屬于1型，2、3型少見(jiàn)；3型多見(jiàn)于西非。此三型其DNA序列差異約為10％，其中大于20％序列差異位于p6啟動(dòng)子區(qū)域。在編碼VP1/VP2蛋白的開(kāi)放閱讀框內(nèi)，2、3型與1型比較，DNA序列變異分別為9％、12％，但氨基酸變異僅

3、為1.1％、1.4％。我們?cè)趪?guó)家自然科學(xué)基金課題（39870021）的資助下，采用基因克隆測(cè)序技術(shù)，對(duì)收集到的中國(guó)大陸B(tài)19病毒流行株（XA株）進(jìn)行基因分析，發(fā)現(xiàn)我國(guó)B19病毒流行株的VP1基因獨(dú)特區(qū)有明顯的變異，其基因組一級(jí)結(jié)構(gòu)的差異，導(dǎo)致所編碼氨基酸的改變，可能影響到B19病毒抗原位點(diǎn)及免疫特性的變化。
　　B19病毒基因的變異可導(dǎo)致病毒毒力、致病機(jī)制的改變。VP1基因表達(dá)的蛋白與病毒的免疫原性及機(jī)體感染后產(chǎn)生保護(hù)性抗體密切相

4、關(guān)，為建立我國(guó)B19病毒感染的防治技術(shù)，必須深入研究我國(guó)病毒流行株變異基因區(qū)表達(dá)的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能位點(diǎn)的變化。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在原核及真核系統(tǒng)表達(dá)B19-XA2株VP1蛋白，研究其空間結(jié)構(gòu)和功能位點(diǎn)的變化及其變化對(duì)抗原性的影響，以揭示變異的VP1基因表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性，促進(jìn)B19病毒分子流行病學(xué)、致病機(jī)理及預(yù)防疫苗的研究。
　　研究目的：
　　本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟跀U(kuò)增獲得B19-XA2VP1基因全長(zhǎng)，構(gòu)建其原核表達(dá)載體，表達(dá)融合蛋

5、白。同時(shí)構(gòu)建VP1穿梭載體，在昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9中表達(dá)VP1蛋白，并以原核及真核表達(dá)蛋白為免疫原，免疫動(dòng)物，制備具有一定敏感性和特異性的抗VP1蛋白的多克隆抗血清，用于檢測(cè)VP1蛋白的免疫原性。分別以原核及真核表達(dá)蛋白為抗原，采用ELISA方法與臨床患兒的血清反應(yīng)，并與德國(guó)ParvovirusB19IgMELISAKit檢測(cè)結(jié)果比較，分析表達(dá)產(chǎn)物VP1蛋白的反應(yīng)原性，從而為以后研究VP1蛋白的生物學(xué)功能，和B19病毒的防治奠定基礎(chǔ)。

6、　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.獲得目的基因自行設(shè)計(jì)引物，按巢式PCR篩選陽(yáng)性B19感染標(biāo)本，自陽(yáng)性標(biāo)本中按照常規(guī)PCR方法擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為2345bp的HPVB19VP1全長(zhǎng)基因（nt2623-nt4968）。
　　2.原核表達(dá)重組蛋白將VP1基因克隆入載體pET28(a)，構(gòu)建原核重組表達(dá)載體VP1-PET28(a)，并在E.coliBL21(DE3)中擴(kuò)增，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)VP1融合蛋白，SDS-PAGE和Western-b

7、lot技術(shù)分析蛋白表達(dá)情況及初步鑒定表達(dá)蛋白。
　　3.真核表達(dá)VP1蛋白將VP1基因及載體pFastbac1雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化入DH10Bac，用抗生素及藍(lán)白斑表型篩選陽(yáng)性重組體，PCR鑒定，獲得含目的基因的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒VP1-Bacmid，用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將陽(yáng)性重組體轉(zhuǎn)入Sf9細(xì)胞，擴(kuò)增病毒，循環(huán)凍融和裂解，超速離心，獲溶解的蛋白質(zhì)上清。
　　4.以原核及真核表達(dá)的重組蛋白為抗原，免疫家兔，制備抗VP1蛋白的多克隆

8、抗血清，ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)；用重組菌超聲裂解上清及轉(zhuǎn)染后Sf9細(xì)胞裂解后上清（均含重組VP1蛋白）包被ELISA板，分別與臨床患兒的血清反應(yīng)，并與德國(guó)ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較，分析表達(dá)產(chǎn)物VP1蛋白的反應(yīng)原性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.巢式PCR篩選到2份陽(yáng)性B19感染標(biāo)本，按照常規(guī)PCR方法擴(kuò)增此2份標(biāo)本，自其中1份標(biāo)本獲得B19VP1全長(zhǎng)基因（2345bp），將其命名為B19-XA2株。
　　2.原核表達(dá)

9、載體VPl-PET28(a)經(jīng)SalⅠ和XbaⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切片段分子量與預(yù)期結(jié)果相符（2345bp），測(cè)序結(jié)果證實(shí)序列完全正確。
　　3.將重組菌VP1-PET28(a)-BL21(DE3)經(jīng)誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)，可表達(dá)分子量約為87kDa的蛋白，經(jīng)Western-blot鑒定，可與6-His抗體結(jié)合，證實(shí)為VP1融合蛋白。
　　4.構(gòu)建穿梭載體VP1-Bacmid，通過(guò)抗生素及藍(lán)白斑表型雙重篩選陽(yáng)性重組體，

10、經(jīng)PCR鑒定，獲得含目的基因的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒VP1-Bacmid，用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將陽(yáng)性重組體轉(zhuǎn)入Sf9細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)典型病變，收集病變細(xì)胞，裂解后SDS-PAGE顯示有分子量87kDa的蛋白表達(dá)，與預(yù)期分子量一致。
　　5.ELISA檢測(cè)原核系統(tǒng)表達(dá)蛋白刺激后產(chǎn)生抗VP1多克隆抗體效價(jià)可達(dá)1：12800。真核系統(tǒng)表達(dá)蛋白刺激后產(chǎn)生抗體效價(jià)可達(dá)1：50000。
　　6.以重組桿狀病毒表達(dá)的VP1蛋白作抗原，與B19病毒陽(yáng)

11、性血清有反應(yīng)，其OD值略低于德國(guó)ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果。而大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的重組VP1蛋白作為抗原，與B19病毒感染后陽(yáng)性血清無(wú)反應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了重組人細(xì)小病毒B19-XA2株VP1全長(zhǎng)基因的E.coli.：VP1-PET28(a)-BL21(DE3)。
　　2.成功構(gòu)建了人細(xì)小病毒B19-XA2株VPl全長(zhǎng)基因重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒VP1-Bacmid，并在昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9中成功表達(dá)VP1蛋白。