胚胎干細胞與蠶絲-膠原支架促進肌腱再生的研究.pdf

1、背景：
　　 隨著國民素質(zhì)的提高以及人們對健康的追求，體育鍛煉和競賽活動明顯增加，以及由于意外事故不斷發(fā)生和社會老齡化趨勢日益明顯，運動損傷也越來越多，其中韌帶肌腱損傷占50％以上。統(tǒng)計表明，每年至少有3000萬的肌腱損傷病例。目前，臨床上對肌腱損傷的治療主要停留在理療、手術(shù)縫合以及自體或異體移植階段，雖有一定效果，但是療效有限，即使是自體肌腱移植修復也只能達到正常肌腱力學性能的40％左右，且伴隨有大量疤痕組織增生。這主要是因為

2、成體肌腱不具備完全再生能力，所以修復后肌腱的質(zhì)量遠不如正常肌腱，易出現(xiàn)肌腱粘連，肌腱結(jié)構(gòu)和力學性能低下，常重復斷裂。因此，尋找新型的、可促進肌腱生理性再生修復的方法具有極其重要的臨床意義。
　　 隨著最近10年組織工程和干細胞研究的興起，使臨床醫(yī)學步入了“再生醫(yī)學”的新階段。通過利用干細胞復合支架材料的組織工程手段，促使身體自主再生已損傷組織，為提高肌腱等軟組織的修復質(zhì)量帶來了全新的機會。肌腱組織工程技術(shù)中包含三個重要的迫切需要

3、解決的關(guān)鍵問題：1）獲得足夠分化成熟的肌腱種子細胞；2）能夠提供足夠生長空間的生物支架材料；3）種子細胞分化的力學刺激以及其他轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。然而，目前這些問題尚未解決，影響了肌腱組織工程的發(fā)展，從而制約了組織工程肌腱在臨床用于肌腱缺損再生修復治療。本研究針對目前這些現(xiàn)狀，旨在系統(tǒng)的研究組織工程肌腱所面臨的三個迫切問題，最終目的為復合誘導后的胚胎干細胞與蠶絲-膠原海綿支架構(gòu)建組織工程肌腱并促進肌腱損傷的再生。研究內(nèi)容包含：在種子細胞選擇

4、、分化和調(diào)控方面，擬采用分子生物學手段調(diào)控誘導人胚胎干細胞階段性向肌腱細胞分化以提供足夠的種子細胞，并闡明力學和轉(zhuǎn)錄因子因素調(diào)控干細胞肌腱分化的機理和協(xié)同效果，獲得有效的肌腱分化條件；本方向的進一步研究將為肌腱分化及再生提供全新的思路和知識，為認知肌腱再生的生物機理提供實驗基礎和理論數(shù)據(jù)，為運用特定分化后肌腱干細胞用于肌腱再生打下基礎。在組織工程支架方面，擬研發(fā)一個既符合組織工程支架需要，又具有生理承載功能的可抗拉力的功能性肌腱支架--

5、蠶絲-膠原海綿復合支架，使之更符合肌腱生物學特性和力學特性。最終將利用研發(fā)的支架復合誘導的人胚胎干細胞，構(gòu)建組織工程肌腱，通過動物模型評估組織工程肌腱對肌腱損傷修復的再生作用。本研究課題，將最終為組織工程肌腱應用于臨床打下基礎，為肌腱損傷治療帶來新的方向。
　　 由于肌腱與韌帶在結(jié)構(gòu)與功能上類似，因此，在本課題中肌腱組織工程泛指肌腱與韌帶組織工程。
　　 本研究分為四個部分：（1）人胚胎干細胞(hESCs)誘導成為間質(zhì)干

6、細胞(MSCs)，并應用于肌腱組織工程研究，探索hESCs促進肌腱再生的可行性和功效性；（2）研究肌腱發(fā)育特征轉(zhuǎn)錄因子SCX對hESCs來源MSCs的肌腱分化影響。闡明SCX對hESC-MSCs的肌腱分化調(diào)控，并獲得SCX+的肌腱祖細胞。在獲得SCX+肌腱祖細胞的基礎上研究外加力學刺激與轉(zhuǎn)錄因子對肌腱分化的協(xié)同效應以及對相關(guān)信號通路的協(xié)同調(diào)控機理，明確肌腱祖細胞向肌腱分化調(diào)控機制；（3）構(gòu)建網(wǎng)狀蠶絲-膠原海綿復合支架，評估該支架用于肌腱

7、/韌帶組織工程的可行性與優(yōu)勢。（4）支架復合誘導后的胚胎干細胞構(gòu)建組織工程肌腱，在動物模型中評估工程化的細胞與支架構(gòu)成的組織工程肌腱對肌腱損傷修復的促進作用。
　　 第一章：人胚胎干細胞的階段性分化通過分泌胚胎肌腱基質(zhì)和分化因子促進肌腱再生
　　 目的：人胚胎干細胞(hESCs)是組織再生的理想種子細胞，但是至今尚未有研究報道人胚胎干細胞用于肌腱再生的可能性。本課題主要研究人胚胎干細胞用于肌腱再生的策略和功效，以及相關(guān)的

8、機理。
　　 方法與結(jié)果：首先，將人胚胎干細胞誘導分化成間充質(zhì)干細胞(MSC)，這種MSC具有三系分化潛能并且表達MSC的表面標記。通過肌腱特異性基因的表達和肌腱結(jié)構(gòu)鑒定證明人胚胎干細胞來源的間充質(zhì)干細胞(hESC-MSCs)不僅在體外組織工程模型還是在體內(nèi)異位肌腱再生模型中都可以再生肌腱組織。在大鼠原位髕腱修復實驗中，用hESC-MSCs處理組與對照組相比具有較好的組織結(jié)構(gòu)和力學性能。另外，hESC-MSCs可以在肌腱損傷區(qū)域

9、存活至少4周，并且分泌人胚胎肌腱特異的胞外基質(zhì)成分和分化因子，這些因子進一步激活肌腱內(nèi)源的再生過程。并且，在所有樣本中均未發(fā)現(xiàn)畸胎瘤形成。
　　 結(jié)論：本研究開創(chuàng)了一種安全有效的將胚胎干細胞用于肌腱再生的方法，并有助于發(fā)展未來應對肌腱疾病的手段。
　　 第二章：轉(zhuǎn)錄因子scleraxis與力學刺激協(xié)同調(diào)控干細胞腱系分化機理和效應研究
　　 目的：缺乏肌腱分化調(diào)控知識是實現(xiàn)肌腱再生的根本性難題。發(fā)育生物學是分化研究

10、的線索。已有肌腱發(fā)育分化研究發(fā)現(xiàn)：1）SCX是肌腱祖細胞的標志，TGF，F(xiàn)GF是肌腱發(fā)育的關(guān)鍵通路，而目前從SCX+祖細胞到肌腱的分化調(diào)控知識缺乏；2）SCX是肌腱發(fā)育的必要但不充分條件，敲除SCX出現(xiàn)嚴重的肌腱缺失；3）肌腱發(fā)育過程提示存在力學刺激促肌腱成熟現(xiàn)象。而力學與SCX在肌腱成熟和分化中的協(xié)同作用及相應機制仍未清楚。本章主要研究SCX+祖細胞向成熟肌腱細胞分化調(diào)控機制，即以SCX+干細胞為起點復合力學刺激誘導肌腱分化，明確SC

11、X與力學刺激對肌腱分化是否有協(xié)同作用并探索其機制。
　　 方法與結(jié)果：第一階段將肌腱發(fā)育特征轉(zhuǎn)錄因子SCX轉(zhuǎn)入hESC來源MSCs，獲得SCX+的肌腱祖細胞。第二階段將在SCX+肌腱祖細胞構(gòu)建的細胞片的基礎上研究外加周期性力學刺激(1Hz)，并揭示力學與轉(zhuǎn)錄因子對肌腱分化的協(xié)同效應以及對相關(guān)信號通路的協(xié)同調(diào)控機理，明確肌腱祖細胞向肌腱分化調(diào)控機制。第三階段，評估SCX復合力學分化的肌腱細胞修復再生修復肌腱的效率。實驗表明：1）S

12、CX可增加肌腱細胞外基質(zhì)（膠原Ⅰ，XIV）表達，并降低膠原Ⅱ表達及BMP活性。然而，SCX亦能增加runx2表達及骨誘導效果。2）在力學協(xié)同刺激下，SCX可增加肌腱特異性基因表達而誘導肌腱分化。3）體內(nèi)異位種植及原位修復結(jié)果顯示，SCX與力學有協(xié)同誘導分化及修復作用，可誘導膠原纖維成熟，并促進肌腱修復。
　　 結(jié)論：該研究表明SCX與力學不僅在肌腱分化中有重要作用，并且能夠協(xié)同作用誘導肌腱分化與修復。SCX與力學刺激的協(xié)同作用部

13、分是通過調(diào)控BMP-Smad通路及runx2的功能。該研究發(fā)現(xiàn)將為肌腱分化調(diào)控提控新知識，并將可能通過更準確調(diào)控干細胞腱系分化為肌腱再生的新的種子細胞和手段。
　　 第三章：網(wǎng)狀蠶絲-膠原海綿復合支架促肌腱再生研究
　　 目的：本課題致力于發(fā)明一種力學性能和生物學性能良好的生物材料，為肌腱韌帶組織工程提供一種同時具備有良好力學性能和足夠相通的細胞組織容納空間的支架，即網(wǎng)狀蠶絲復合膠原海綿支架。
　　 方法與結(jié)果：

14、該支架用于韌帶肌腱組織工程的功效性通過體外和動物體內(nèi)進行評估。在膠原基質(zhì)上培養(yǎng)的細胞與生長在蠶絲上的細胞高表達肌腱韌帶的胞外基質(zhì)基因。小鼠皮下移植實驗結(jié)果顯示蠶絲支架有很好的生物相容性，并會緩慢的降解。兔內(nèi)側(cè)副韌帶損傷模型顯示，將網(wǎng)狀蠶絲復合膠原海綿支架用于內(nèi)側(cè)副韌帶的修復得到更多的膠原沉積和更好的力學性能，與未修復和單純蠶絲支架修復效果相比，實驗組超微結(jié)構(gòu)的膠原直徑更大且支架和肌腱的交界點修復更強。
　　 結(jié)論：本研究結(jié)果證明

15、了網(wǎng)狀蠶絲復合膠原海綿支架通過調(diào)控肌腱韌帶胞外基質(zhì)基因的表達和膠原纖維的聚合促進了肌腱結(jié)構(gòu)和功能的修復。這些發(fā)現(xiàn)第一次強調(diào)了生物材料在肌腱韌帶再生生物學中的重要角色。另外，“內(nèi)部空間預留”的支架概念的提出有利于處于力學張力下組織的修復。
　　 第四章：基因工程化hESC-MSC與蠶絲-膠原海綿復合支架構(gòu)建組織工程肌腱研究
　　 目的：我們之前的研究中已證明復合了膠原的蠶絲支架在肌腱再生中擁有良好的潛能，并證實hESC-M

16、SCs及SCX+hESC-MSCs在肌腱分化及促進修復肌腱再生中的潛能。本研究旨在應用支架復合誘導后的胚胎干細胞構(gòu)建組織工程肌腱，在動物模型中評估工程化的細胞與支架構(gòu)成的組織工程肌腱對肌腱損傷修復的促進作用。
　　 方法與結(jié)果：體外實驗將hESC-MSC及工程化SCX+hESC-MSC種在復合支架上在體外施以動態(tài)力學刺激(DM)或無力學刺激(NM)達14天。體內(nèi)異位種植則埋入裸鼠皮下4周，部分通過將構(gòu)建物縫合在裸鼠背部脊上韌帶施

17、以天然的力學刺激(DM)，其他的則不受力(NM)。原位跟腱修復分別于固定后2周，4周，進行大體、組織學、超微結(jié)構(gòu)、生化組成、生物力學檢測。力學刺激誘導了復合膠原蠶絲支架上的hESC-MSC及SCX+hESC-MSC向肌腱方向分化，體內(nèi)異位移植肌腱的組織學、生化組成和膠原表達、膠原纖維大小均大于無力學組，兩種細胞間差異并不明顯。肌腱修復結(jié)果顯示細胞促進形成更成熟的膠原纖維，并促進損傷肌腱的修復。另外SCX+hESC-MSC可促進修復肌腱的