力學(xué)因素對活化肝星狀細(xì)胞類視黃醇代謝的影響.pdf

1、研究背景與目的：
　　 各種慢性肝病向終末期肝硬化發(fā)展過程中所必經(jīng)的一個病理過程是肝纖維化。肝纖維化這一環(huán)節(jié)是可逆的，而肝硬化一旦發(fā)生就不可逆轉(zhuǎn)。由此可見，通過深入研究和探討肝纖維化的發(fā)生機制對預(yù)防肝硬化的發(fā)生具有非常重要的現(xiàn)實意義。
　　 肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。肝纖維化的發(fā)生與細(xì)胞外基質(zhì)的分泌與沉積密切相關(guān)，然而位于Disse間隙內(nèi)的HSC正

2、是肝臟內(nèi)分泌細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞。隨著肝纖維化的發(fā)展，門脈壓力不斷增高，肝竇擴(kuò)張，HSC所受的壓力、牽拉力逐漸增大，本課題組的前期工作已證實HSC胞外力學(xué)環(huán)境的變化可調(diào)節(jié)HSC的增殖活化。
　　 近期研究發(fā)現(xiàn)，通過透射電鏡觀察HSC，發(fā)現(xiàn)HSC核周圍圍繞著由類視黃醇物質(zhì)組成的“脂滴”，肝纖維化發(fā)生后，HSC核周圍的“脂滴”逐漸消失。提示胞外力學(xué)環(huán)境的變化有可能調(diào)節(jié)HSC的類視黃醇代謝。由此可得出本論文的研究目的，即通過研究力學(xué)因

3、素對HSC內(nèi)類視黃醇代謝的影響來進(jìn)一步證明力學(xué)因素與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，從而尋找預(yù)防肝硬化發(fā)生的新方法。
　　 本實驗通過體外分離大鼠HSC，應(yīng)用壓力及牽拉力細(xì)胞加載模型，觀察壓力和牽拉力對HSC內(nèi)類視黃醇代謝的作用，并研究肝纖維化發(fā)生的可能機制。本實驗由三部分組成:正常大鼠HSC的分離、培養(yǎng)及鑒定;壓力及牽拉力對大鼠HSC內(nèi)類視黃醇代謝及活化的影響;壓力及牽拉力促HSC活化機制的相關(guān)研究。
　　 實驗方法：<

4、br>　　 一、正常大鼠HSC的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 采用大體重的雄性老年SD大鼠，在體門靜脈插管并灌注相應(yīng)的酶消化液后，通過使用27.8％Nycodenz分離液，采用密度梯度離心法獲取HSC。HSC分離后培養(yǎng)于含10％FBS的DMEM中，并于48h更換培養(yǎng)基液體。
　　 分離的HSC分別通過臺盼藍(lán)染色法、自發(fā)免疫熒光法及免疫熒光染色法鑒定HSC的細(xì)胞存活率及純度。
　　 二、壓力對HSC視黃醇代謝及活化影響

5、的檢測
　　 （一）細(xì)胞壓力加載方法
　　 將體外培養(yǎng)14天的活化HSC接種在六孔板上后置于壓力加載裝置中，通過輸入惰性氣體高壓氦氣來達(dá)給HSC施加壓力的目的，同時通過所連接的血壓計來控制所施加壓力的大小。壓力加載完畢后將裝置置于恒溫37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　 （二）HSC視黃醇代謝因子及活化的檢測
　　 體外培養(yǎng)14天的活化HSC按1×106cells/ml的密度接種于六孔板上，使用不含F(xiàn)BS的高糖培

6、養(yǎng)基預(yù)先同步化24h后進(jìn)行壓力加載(10mmHg，1h)。壓力加載完畢后提取細(xì)胞總RNA及總蛋白，采用實時熒光定量PCR法檢測LRAT、CRBP-(I)、REH、RAR-β、RXR-α、α-SMA與Collagen-ImRNA的表達(dá)，Western-blot法檢測LRAT、CRBP-I、REH、RAR-β、RXR-α、α-SMA與Collagen-(I)的蛋白表達(dá)。
　　 三、牽拉力對HSC視黃醇代謝及活化影響的檢測
　　

7、 （一）細(xì)胞牽拉力加載方法
　　 采用Flexcell FX-4000T牽拉裝置，將體外培養(yǎng)14天的活化HSC接種在鼠尾膠原包被后的Flexcell六孔板上，培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)的BioFlex Culture Plate底座上，開啟真空泵和橋接器，啟動Flexercell Strain中央控制器，設(shè)定牽拉參數(shù)進(jìn)行牽拉。
　　 （二）HSC視黃醇代謝因子及活化的檢測
　　 體外培養(yǎng)14天的活化HSC按1×106c

8、ells/ml的密度接種于Flexcell六孔板上，使用不含F(xiàn)BS的高糖培養(yǎng)基預(yù)先同步化24h后進(jìn)行牽拉力加載（10％牽拉幅度、0.5Hz牽拉頻率、牽拉24小時）。牽拉力加載完畢后立即提取細(xì)胞總RNA及總蛋白，采用實時熒光定量PCR法檢測LRAT、CRBP-(I)、REH、RAR-β、RXR-α、α-SMA與Collagen-ImRNA的表達(dá)，Western-blot法檢測LRAT、CRBP-(I)、REH、RAR-β、RXR-α、α-

9、SMA與Collagen-(I)的蛋白表達(dá)。
　　 四、壓力促HSC活化機制研究的方法
　　 10mmHg壓力作用1h，應(yīng)用特異性阻滯劑HX531阻斷RXR-α與受體結(jié)合;LE135阻斷RAR-β與受體結(jié)合;應(yīng)用實時熒光定量PCR法檢測LRAT、CRBP-(I)、REH、RAR-β、RXR-α、α-SMA與Collagen-(I)mRNA的表達(dá);Western-blot法檢測LRAT、CRBP-(I)、REH、RAR-β

10、、RXR-α、α-SMA與Collagen-(I)蛋白表達(dá)。
　　 、牽拉力促HSC活化機制研究的方法
　　 10％牽拉幅度，0.5Hz牽拉頻率，牽拉24h，應(yīng)用特異性阻滯劑HX531阻斷RXR-α與受體結(jié)合;LE135阻斷RAR-β與受體結(jié)合;應(yīng)用實時熒光定量PCR法檢測LRAT、CRBP-(I)、REH、RAR-β、RXR-α、α-SMA與Collagen-(I)mRNA的表達(dá);Westem-blot法檢測LRAT、

11、CRBP-(I)、REH、RAR-β、RXR-α、α-SMA與Collagen-(I)蛋白的表達(dá)。
　　 六、實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析
　　 實驗所得數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包處理，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 一、HSC的存活率及純度鑒定
　　 臺盼藍(lán)染色法，自發(fā)免疫熒光法，Desmin、α-SMA免疫熒光染色法檢測分離培養(yǎng)的HSC細(xì)胞存活率及純度均達(dá)95％以上，完

12、全滿足實驗需求，可以用于后續(xù)實驗。
　　 二、壓力對活化HSC內(nèi)類視黃醇代謝及活化的影響
　　 活化（14天）HSC用于壓力加載實驗，10mmHg壓力作用1h明顯促進(jìn)活化HSC內(nèi)α-SMA和collagen-(I)的表達(dá)(p＜均0.01);能抑制視黃醇代謝因子LRAT、CRBP-(I)、REH、RAR-β、RXR-α的表達(dá)（p均＜0.05）。
　　 三、牽拉力對活化HSC內(nèi)類視黃醇代謝及活化的影響
　　

13、活化(14天)HSC用于牽拉力加載實驗，10％牽拉幅度，0.5Hz牽拉頻率，牽拉24h明顯促進(jìn)活化HSC內(nèi)α-SMA和collagen-(I)的表達(dá)（p均＜0.01）;能抑制視黃醇代謝因子LRAT、CRBP-(I)、REH、RAR-β、RXR-α的表達(dá)（p均＜0.05）。
　　 四、阻滯劑對壓力所誘導(dǎo)的活化HSC內(nèi)類視黃醇代謝途徑的影響
　　 實驗分為對照Control組(C)、單純壓力Pressure組(P)、壓力+H

14、X531組(PHX531)、壓力+LEI35組(PLE135)。與C組相比，P組能明顯促進(jìn)活化HSC內(nèi)α-SMA和collagen-(I)的表達(dá)（p均＜0.01），能明顯抑制LRAT、CRBP-(I)、REH、RAR-β、RXR-α的表達(dá)（p均＜0.05）;與P組相比，PHX531組能明顯抑制活化HSC內(nèi)α-SMA和collagen-(I)的表達(dá)（p均＜0.05），促進(jìn)LRAT、CRBP-(I)、REH、RAR-β、RXR-α的表達(dá)（p

15、均＜0.05）;與P組相比，PLE135組能明顯抑制活化HSC內(nèi)α-SMA和collagen-(I)的表達(dá)(p＜均0.05)，促進(jìn)LRAT、CRBP-(I)、REH、RAR-β、RXR-α的表達(dá)（p均＜0.05）。
　　 五、阻滯劑對牽拉力所誘導(dǎo)的活化HSC內(nèi)類視黃醇代謝途徑的影響
　　 實驗分為對照Control組(C)、單純牽拉Stretch組(S)、牽拉+HX531組(SHX531)、牽拉+LE135組(SLE13

16、5)。與C組相比較，S組能明顯促進(jìn)活化HSC內(nèi)α-SMA和collagen-(I)的表達(dá)（p均＜0.01），能明顯抑制LRAT、CRBP-(I)、REH、RAR-β、RXR-α的表達(dá)（p均＜0.05）;與S組相比，SHX531組能明顯抑制活化HSC內(nèi)α-SMA和collagen-(I)的表達(dá)（p均＜0.05），促進(jìn)LRAT、CRBP-(I)、REH、RAR-β、RXR-α的表達(dá)（p均＜0.05）;與S組相比，SLE135組能明顯抑制活化

17、HSC內(nèi)α-SMA和collagen-(I)的表達(dá)（p均＜0.05），促進(jìn)LRAT、CRBP-(I)、REH、RAR-β、RXR-α的表達(dá)（p均＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 一、壓力和牽拉力能促進(jìn)活化HSC內(nèi)α-SMA和collagen-(I)的表達(dá)，抑制視黃醇代謝因子的表達(dá)，提示肝纖維化發(fā)生時，肝竇內(nèi)壓力的升高可通過促進(jìn)HSC的激活來推進(jìn)肝纖維化及門脈高壓的發(fā)展且可促進(jìn)HSC內(nèi)類視黃醇物質(zhì)分解。
　　 二