轉(zhuǎn)染LMP-1基因人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與退變髓核細(xì)胞體外雙層細(xì)胞微球三維條件下共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分人退變髓核細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)擴(kuò)增、鑒定及細(xì)胞微球三維培養(yǎng)與單層培養(yǎng)對其類軟骨表型的影響
　　 目的：探討人退變髓核細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)擴(kuò)增及鑒定方法，并觀察細(xì)胞微球三維培養(yǎng)對其生物學(xué)特性的影響。
　　 方法：收集25例人退變椎間盤手術(shù)髓核標(biāo)本組織，體外采用0.025％的Ⅱ型膠原酶消化法將原代髓核細(xì)胞分離并連續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增傳代。利用倒置相差顯微鏡觀察髓核細(xì)胞形態(tài)變化，通過Ⅱ型膠原及aggrecan免疫熒光化學(xué)染色法鑒

2、定髓核細(xì)胞類軟骨表型分子的表達(dá)。分別采用常規(guī)單層培養(yǎng)和細(xì)胞微球三維培養(yǎng)退變髓核細(xì)胞，共設(shè)3個觀察時間點(diǎn)(7、14、21天)。通過RT-PCR方法檢測兩組細(xì)胞aggrecan、Ⅱ型膠原及SOX-9等基因的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：應(yīng)用0.025％的II型膠原酶37℃消化4小時即可分離出一定數(shù)量的原代人退變髓核細(xì)胞；體外培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)其平均8天貼壁，細(xì)胞呈梭形、類圓形或多角性，細(xì)胞達(dá)到80％融合平均約需4周。免疫熒光化學(xué)及甲苯胺藍(lán)染色法

3、檢測發(fā)現(xiàn)分離培養(yǎng)的髓核細(xì)胞可表達(dá)Ⅱ型膠原及aggrecan蛋白。RT-PCR檢測結(jié)果顯示細(xì)胞微球三維培養(yǎng)組髓核細(xì)胞aggrecan、Ⅱ型膠原蛋白及SOX-9基因的表達(dá)顯著高丁．單層培養(yǎng)組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：采用0.025％的Ⅱ型膠原酶消化法可從退變椎間盤手術(shù)標(biāo)本中分離出一定數(shù)量退變髓核細(xì)胞。該細(xì)胞呈類軟骨表型（表達(dá)蛋白多糖和Ⅱ型膠原）。與常規(guī)單層培養(yǎng)相比，細(xì)胞微球三維培養(yǎng)可較好地保持其類軟骨表型。
　　 第二

4、部分人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)擴(kuò)增、鑒定及單層與三維誘導(dǎo)環(huán)境對其成軟骨分化效應(yīng)的影響
　　 目的：體外分離、培養(yǎng)擴(kuò)增人脂肪組織米源的間充質(zhì)干細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞儀及多向誘導(dǎo)分化對其干細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定。
　　 方法：取10例剖腹產(chǎn)手術(shù)皮下脂肪標(biāo)本，采用0.075％的Ⅰ型膠原酶消化法結(jié)合反復(fù)貼壁法分離培養(yǎng)并純化人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，流式細(xì)胞儀檢測干細(xì)胞表型分子。隨后分別在單層和細(xì)胞

5、微球三維環(huán)境下誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞定向成脂、成骨及成軟骨分化，并采用油紅O染色、Alizareen染色、Safranin'O染色、甲苯胺藍(lán)染色、aggrecan及Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色法檢測。此外，應(yīng)用RT-PCR方法檢測單層誘導(dǎo)和細(xì)胞微球三維誘導(dǎo)環(huán)境下，人脂肪干細(xì)胞成軟骨分化后的基因表達(dá)。
　　 結(jié)果：應(yīng)用0.075%的Ⅰ型膠原酶37℃消化約1小時即可分離出較多的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。原代人脂肪干細(xì)胞平均3天貼壁，達(dá)到80%

6、融合約需9天；傳至3代后，轉(zhuǎn)變成均一的長梭形，并早漩渦狀排列。流式細(xì)胞儀檢測分析發(fā)現(xiàn)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD90、CD105分子，低表達(dá)CD34、CD45分子及HLA-DR。單層環(huán)境下多向誘導(dǎo)21天后，油紅O染色、Alizareen染色、Safranin'O染色均呈陽性。細(xì)胞微球三維環(huán)境下成軟骨誘導(dǎo)21天后，細(xì)胞團(tuán)呈明顯的軟骨樣形態(tài)，切片HE染色可見清晰的軟骨特征樣的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)分層排列。甲苯胺藍(lán)、Masson三色染色

7、、及Ⅱ型膠原、aggrecan免疫組化染色均呈陽性。RT-PCR結(jié)果顯示細(xì)胞微球三維環(huán)境下誘導(dǎo)的人脂肪干細(xì)胞軟骨樣表型基因（aggrecan、Ⅱ型膠原及SOX-9）高于單層誘導(dǎo)組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：通過Ⅰ型膠原酶消化結(jié)合反復(fù)貼壁法可獲得大量純化的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，該細(xì)胞體外具有多向分化潛能，并且細(xì)胞微球三維誘導(dǎo)環(huán)境更適合其成軟骨分化。
　　 第三部分?jǐn)y帶LMP-1-GFP基因的慢病毒載體構(gòu)建、鑒定、轉(zhuǎn)染人脂

8、肪干細(xì)胞及LMP-1基因?qū)?xì)胞微球三維誘導(dǎo)環(huán)境下人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化效應(yīng)的影響
　　 目的：構(gòu)建攜帶人LMP-1基因的慢病毒載體并對其進(jìn)行鑒定，以獲得高滴度的攜帶LMP-1基因慢病毒載體用于脂肪干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。觀察LMP-1基因?qū)?xì)胞微球三維誘導(dǎo)環(huán)境下人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化效應(yīng)的影響。
　　 方法：根據(jù)人LMP-1基因（GeneBank序號：NM005451）mRNA，設(shè)計并合成全基因的引物。從購買的cDNA

9、文庫中，利用PCR方法釣取目的基因。將目的基因與酶切線性化的載體進(jìn)行定向交換，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞。對長出的克隆先進(jìn)行菌落PCR鑒定，再對PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行測序和比對分析，比對正確的克隆即為構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒。最后將構(gòu)建好的融合蛋白表達(dá)載體進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素抽提得到較高滴度、可表達(dá)LMP-1-GFP基因及GFP基因的慢病毒載體。并分別用于轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞得到表達(dá)LMP-1-GFP基因或GFP基因的人脂肪干細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染LMP-1-G

10、FP基因和GFP基因的人脂肪干細(xì)胞分別置于細(xì)胞微球三維環(huán)境中進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)分化。其中，轉(zhuǎn)染LMP-1-GFP基因的脂肪干細(xì)胞分別采用含TGF-β3的成軟骨誘導(dǎo)基和不含TGF-β3的成軟骨基礎(chǔ)誘導(dǎo)基進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)，同時用含TGF-β3的軟骨誘導(dǎo)基對單純表達(dá)GFP基因的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)并設(shè)為對照組。誘導(dǎo)21天后，采用RT-PCR方法檢測各組誘導(dǎo)細(xì)胞軟骨表型基因的表達(dá)，觀察LMP-1基因能否誘導(dǎo)細(xì)胞微球三維環(huán)境下人脂肪干細(xì)胞成軟骨分化

11、及其與TGF-β3誘導(dǎo)效應(yīng)之間是否存在差異。
　　 結(jié)果：通過上述方法獲得了高滴度(2x109TU/ml)的攜帶LMP-1基因的慢病毒。成軟骨誘導(dǎo)對比實(shí)驗(yàn)表明TGF-β3誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染LMP-1基因的人脂肪干細(xì)胞成軟骨分化效應(yīng)最強(qiáng)，其次為采用不含TGF-β3的成軟骨基礎(chǔ)誘導(dǎo)基誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染LMP-1基因的脂肪干細(xì)胞，而采用含TGF-β3的成軟骨誘導(dǎo)基誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染GFP基因的人脂肪干細(xì)胞分化效應(yīng)相對較弱，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05

12、)。
　　 結(jié)論：慢病毒是一種良好的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體工具，可有效地轉(zhuǎn)染人脂肪干細(xì)胞并獲得相關(guān)基因大量表達(dá)。與BMP-2、-7成軟骨效應(yīng)類似，LMP-1基因也可誘導(dǎo)細(xì)胞微球三維誘導(dǎo)環(huán)境下人脂肪干細(xì)胞成軟骨分化，并且該效應(yīng)高于傳統(tǒng)的誘導(dǎo)因子TGF-β3。此外，兩者之間存在協(xié)同效應(yīng)。
　　 第四部分雙層細(xì)胞微球三維共培養(yǎng)環(huán)境下人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與退變髓核細(xì)胞間相互效應(yīng)的觀察及LMP-1基因?qū)υ撔?yīng)的影響
　　 目的：觀察并

13、檢測LMP-1基因?qū)θ酥鹃g充質(zhì)干細(xì)胞與退變髓核細(xì)胞在雙層微球微球共培養(yǎng)環(huán)境下相互效應(yīng)的影響，并分析相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：采用攜帶LMP-1-GFP或GFP基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得表達(dá)LMP-1-GFP或GFP基因的人脂肪干細(xì)胞。將其與退變髓核細(xì)胞在雙層細(xì)胞微球三維環(huán)境下共培養(yǎng)，同時設(shè)立混合細(xì)胞微球三維共培養(yǎng)及單獨(dú)細(xì)胞微球三維培養(yǎng)組作為對照。共設(shè)立7個細(xì)胞培養(yǎng)組，分別為轉(zhuǎn)染GFP基因脂肪干細(xì)胞三維細(xì)胞微球單

14、獨(dú)培養(yǎng)組，轉(zhuǎn)染GFP基因脂肪干細(xì)胞與退變髓核細(xì)胞混合細(xì)胞微球三維共培養(yǎng)組、轉(zhuǎn)染GFP基因脂肪干細(xì)胞與退變髓核細(xì)胞雙層細(xì)胞微球三維共培養(yǎng)組、轉(zhuǎn)染LMP-1-GFP基因脂肪干細(xì)胞三維細(xì)胞微球單獨(dú)培養(yǎng)組、轉(zhuǎn)染LMP-1-GFP基因脂肪干細(xì)胞與退變髓核細(xì)胞混合細(xì)胞微球三維共培養(yǎng)組、轉(zhuǎn)染LMP-1-GFP基因脂肪干細(xì)胞與退變髓核細(xì)胞雙層細(xì)胞微球三維共培養(yǎng)組及髓核細(xì)胞三維細(xì)胞微球單獨(dú)培養(yǎng)組。設(shè)立3個觀察時間點(diǎn)：7、14、21天，采用阿利新藍(lán)法檢測各

15、自蛋白聚糖含量，并通過流式細(xì)胞分選方法將表達(dá)GFP基因的脂肪干細(xì)胞與GFP表達(dá)陰性髓核細(xì)胞分離開來，采用RT-PCR方法檢測共培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞和退變髓核細(xì)胞各白aggrecan、Ⅰ、Ⅱ型膠原及SOX-9基因表達(dá)變化，并與單獨(dú)培養(yǎng)組相比較。此外，我們還采用Westem-blot蛋白免疫電泳法對各培養(yǎng)組脂肪干細(xì)胞上述基因變化在蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行了檢測。
　　 結(jié)果：自培養(yǎng)的第14天起，雙層細(xì)胞微球三維共培養(yǎng)組蛋白多糖合成高于其余各細(xì)胞

16、培養(yǎng)組(P＜0.05)，此外，轉(zhuǎn)染LMP-1-GFP基因脂肪干細(xì)胞與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)組蛋白多糖合成量顯著高于轉(zhuǎn)染GFP基因脂肪干細(xì)胞與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)組(P＜0.05)。RT-PCR檢測顯示，自培養(yǎng)第7大起，細(xì)胞微球三維共培養(yǎng)組髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原、SOX-9及Aggrecan等基因表達(dá)均高于單獨(dú)髓核細(xì)胞三維微球培養(yǎng)組(P＜0.05)。但雙層細(xì)胞微球三維共培養(yǎng)組髓核細(xì)胞上述基因表達(dá)與混合細(xì)胞微球三維共培養(yǎng)組髓核細(xì)胞表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05

17、)。此外，與轉(zhuǎn)染LMP-1-GFP基因脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原、SOX-9及Aggrecan基因表達(dá)高于與轉(zhuǎn)染GFP基因脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)髓核細(xì)胞(P＜0.05)。此外，所有細(xì)胞微球三維培養(yǎng)組髓核細(xì)胞Ⅰ型膠原基因表達(dá)均隨時間增長逐漸降低(P＜0.05)。除Ⅰ型膠原外，脂肪干細(xì)胞三維細(xì)胞微球單獨(dú)培養(yǎng)組未見上述基因表達(dá)。雙層細(xì)胞微球三維共培養(yǎng)組脂肪干細(xì)胞上述基因表達(dá)高于混合細(xì)胞微球三維共培養(yǎng)組(P＜0.05)。此外，轉(zhuǎn)染LMP-1-G

18、FP基因脂肪干細(xì)胞上述基因表達(dá)高于轉(zhuǎn)染GFP基因脂肪干細(xì)胞(P＜0.05)。三維細(xì)胞微球單獨(dú)培養(yǎng)組脂肪干細(xì)胞Ⅰ型膠原基因表達(dá)逐漸增高，但細(xì)胞微球三維共培養(yǎng)組脂肪干細(xì)胞Ⅰ型膠原基因表達(dá)呈逐漸下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜O.05)。此外，除Ⅰ型膠原外，雙層細(xì)胞微球三維共培養(yǎng)組轉(zhuǎn)染GFP基因脂肪干細(xì)胞上述基因表達(dá)高于混合細(xì)胞微球三維共培養(yǎng)組轉(zhuǎn)染LMP-1基因脂肪干細(xì)胞(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：雙層細(xì)胞微球三維共培養(yǎng)較混合細(xì)胞