骨髓增生異常綜合征(MDS)的流式診斷及表觀遺傳學發(fā)病機制研究.pdf

1、上篇流式細胞術在鑒別診斷MDS和疾病特征及預后指示中的臨床應用
　　第一章基于CD34+細胞免疫表型的低危MDS流式診斷積分系統(tǒng)的構建及相關免疫表型模式的生物學意義探討
　　目的:研究低危骨髓增生異常綜合征(MDS)骨髓中CD34+原始細胞免疫表型模式以及在疾病診斷及預后中的意義。
　　材料與方法:采用CD45/SSC設門四色流式細胞術檢測21例正常人和良性血液病(基準組)、核型異常IPSS分類低危MDS患者21例(陽

2、性對照組)、核型正常IPSS分類低危MDS患者45例(待檢組)和16例IPSS分類高危MDS/MDS-AML患者CD34+原始細胞比例,以及下列抗原在CD34+細胞中的表達比例:CD117、CD133、CD11b、CD15、CD4、CD56;以良性血液病患者免疫表型表達(均數(shù)+2個標準差)為基準,任一種抗原表達超過這個基準值則定義為異?；蜿栃?評為1分),建立流式評分系統(tǒng)對MDS患者進行評分。
　　結果:①基準組流式評分0-2分和

3、3-7分的比例分別為100％(21/21)和0％(0/21);陽性對照組患者流式評分0-2分和3-7分的比例分別為23.8％(5/21)、76.2％(16/21);核型正常低危MDS患者流式評分0-2分和3-7分的比例分別為22.2％(10/45)、77.8％(35/45);高危組流式評分為0-2分和3-7分的比例分別為25.0％(4/16)和75.0％(12/16);流式評分診斷核型正常MDS的靈敏度和特異性可達77.8％和100％。

4、②核型正常低危患者CD34+細胞超過基準值者比例較低,且共表達CD117比例也低,主要表現(xiàn)為CD34+細胞共表達CD133、CD11b/CD15和CD4/CD56;而高危組病例CD34+細胞超過基準值者比例明顯升高,共表達CD117/CD133超過基準值者比例極高,但共表達髓系成熟抗原(CD11b/CD15)和淋系抗原(CD4/CD56)超過基準值者比例極低。核型異常低危組情況介于上述兩組之間。③低危MDS患者CD11b和CD15以及C

5、D4和CD56在CD34+細胞中具有顯著的同步表達,CD117和CD133在CD34+細胞中的表達比例不顯示同步表達。④低危MDS患者流式評分與IPSS積分顯示微弱正相關;其中與外周血細胞減少系數(shù)顯示正相關,與骨髓形態(tài)學原始細胞比例明顯反相關,與核型預后(好/中/差)無明顯相關。⑤骨髓低增生和HLA-DR15陽性患者通常獲得較高的流式評分(4分或更高)。⑥在本積分系統(tǒng)中,獲得高流式積分的MDS患者總生存優(yōu)于低流式積分患者。
　　結

6、論:①由CD34+原始細胞相關免疫表型構建的流式評分在輔助診斷無染色體異常/無環(huán)形鐵粒幼細胞增多/無原始細胞增多的低危MDS上顯示良好的敏感性和特異性。②本系統(tǒng)中核型正常的低危MDS→核型異常的低危MDS→高危MDS/MDS-AML,不同的CD34+原始細胞比例及其免疫表型表達模式可能體現(xiàn)了疾病的克隆性演化。③低危MDS的免疫發(fā)病因素可能是該流式系統(tǒng)的病理基礎。
　　第二章改進的MDS流式診斷積分系統(tǒng)的建立與鞏固及其臨床意義分析<

7、br>　　目的:通過納入新的具有特定意義的免疫表型,構建一個改進的通用型MDS流式診斷積分系統(tǒng),評估其在各類MDS亞型中的診斷價值,并探討分析該流式積分系統(tǒng)的臨床意義。
　　材料與方法:診斷列和鞏固列雙列設計:診斷列包括檢測45例對照組患者(良性血液病)和99例MDS組患者(核型正常WHO分類低危MDS50例,核型異常低危MDS23例,高危MDS26例),鞏固列包括28例良性血液病患者和20例MDS患者。采用CD45/SSC設門四

8、色流式細胞術CD34+原始細胞比例,以及下列抗原在CD34+細胞中的表達比例:CD38、CD19、CD117、CD7、CD11b、CD15、CD4、CD56;以對照組免疫表型表達為基準(均數(shù)加或減2個標準差)或通過受試者工作特征曲線(ROC曲線)來計算基準值,任一種抗原表達低于或超過這個基準值則定義為異常或陽性,其中CD34+細胞比例評分按照以下規(guī)則:2.5％、5-10％和＞10％分別評為1分、2分和3分,CD19或CD38表達低于基準

9、值評為1分,CD117、CD7、CD11b、CD15、CD4或CD56表達超過基準值評為1分,各項評分累積為MDS患者的流式總分。
　　結果:①基準對照組流式評分0-3分和4-7分的比例分別為100％(21/21)和0％(0/21),MDS組患者流式評分0-3分和3-7分的比例分別為18.2％(5/21)和81.8％(16/21)。流式評分診斷MDS的靈敏度和特異性可達81.8％和100％。②鞏固分析顯示該系統(tǒng)診斷鞏固組MDS的敏

10、感性和特異性達到85.0％和92.9％,與診斷組敏感性和特異性相符;診斷正確率(流式診斷與臨床/形態(tài)診斷相符率)可達89.6％。③核型正常低危MDS患者CD34+細胞高表達淋系和成熟髓系抗原CD4、CD56、CD15和CD11b,而核型異常MDS患者CD34+細胞高表達干祖細胞分化及增殖抗原CD34、CD38、CD19、CD117和CD7,核型異常低危MDS上述抗原表達介于二者之間。④來自于CD4、CD56、CD15和CD11b異常表達

11、的流式積分定義為早期積分,而來自于CD34、CD38、CD19、CD117和CD7異常表達的積分定義為進展積分:低危MDS獲得高的早期積分,高危MDS獲得高的進展積分;早期積分和進展積分相互拮抗;低增生MDS獲得高的早期積分,高增生MDS獲得高的進展積分。⑤流式總積分和進展積分與WHO分類和IPSS預后分類呈正相關,而早期積分與IPSS預后分類呈反相關;⑥流式總積分與MDS患者是否存在輸血依賴無關聯(lián);高的流式總積分和進展積分預示著MDS

12、患者較差的生存,相反的是,早期積分卻是MDS患者預后好的一個標志;此外,同時具有高的早期積分和進展積分的患者顯示最差的生存。
　　結論:①改進的流式積分系統(tǒng)無論是診斷低危MDS還是高危MDS均展現(xiàn)了良好的敏感性和特異性,有助于我們在臨床診斷前提供一個初步診斷或協(xié)助診斷;②兩種針對疾病早期或進展的積分分布設定可協(xié)助我們對MDS患者分類和預后進行合理判斷;③獨特的抗原表達模式和流式積分分布反映了疾病克隆性演化的階段特點。
　　下

13、篇PcG家族蛋白在MDS表觀遺傳學發(fā)病機制中的作用研究
　　第三章 MDS患者PcG家族基因表達水平分析以及與p15INK4B甲基化、表觀遺傳治療和疾病預后的關系
　　目的:PcG家族是影響表觀遺傳學修飾的關鍵基因家族,然而其在MDS中的研究罕見報道。在本章節(jié)中,我們首次研究MDS患者骨髓PcG家族基因BM11、EZH2、RING1、SUZ12和EED表達水平,并分析其與p15INK4B甲基化、地西他濱治療和疾病預后的關系。

14、
　　材料與方法:采用實時熒光定量PCR檢測21例正常對照、54例MDS患者、15例MDS轉化的AML(MDS-AML)患者骨髓單個核細胞PcG家族基因BMI1、RING1、EZH2、SUZ12和EED表達水平;地西他濱治療前后的PcG基因表達水平也被檢測;甲基化特異性PCR檢測MDS患者p15INK4B甲基化狀況。在此基礎上,分析PcG家族基因表達與p15INK4B甲基化、地西他濱治療、IPSS預后積分及生存時間的關系。

15、　　結果:①與正常對照相比,MDS和MDS-AML患者BMI1、EZH2和RING1基因表達水平明顯增高,而SUZ12和EED表達水平無明顯差別;高危MDS與低危MDS相比有著更高的BMI1、EZH2和RING1基因表達;在MDS患者中,BMI1、EZH2和RING1三者表達水平呈現(xiàn)明顯的同步相關性。②70.4％的MDS病人展現(xiàn)p15INK4B甲基化:與無p15INK4B甲基化的病人相比,p15INK4B甲基化的MDS病人伴有明顯增高的

16、EZH2基因表達,但不伴有BMI1、RING1、SUZ12和EED表達增高。③地西他濱治療后p15INK4B甲基化異常頻率下降,EZH2和RING1表達水平明顯下降,但BMI1表達水平與治療前無明顯差別。④增高BMI1、EZH2和RING1基因表達水平與患者不利的IPSS預后積分正相關,此外也與患者外周血細胞減少嚴重程度和骨髓原始細胞比例增高正相關。⑤BMI1、EZH2和EED表達水平高的患者伴有較差的生存,而RING1和SUZ12表達

17、水平對生存無顯著影響;BMI1和EZH2是MDS患者獨立的預后因素。
　　結論:①PcG家族基因BMI1、EZH2和RING1的過表達頻繁發(fā)生于MDS,且預示著患者不利的預后積分和生存。②EZH2高表達伴隨著高的p15INK4B甲基化發(fā)生,且在地西他濱治療后表達明顯下降,提示了EZH2可能參與了MDS的表觀遺傳學發(fā)病。
　　第四章 PcG蛋白BMI1在MDS克隆細胞增殖凋亡轉換中的作用機制研究
　　目的:PcG蛋白BM

18、I1在正常造血和白血病干細胞的自我更新和增殖中發(fā)揮關鍵作用。上一章我們已經發(fā)現(xiàn)MDS患者單個核細胞過表達BMI1 mRNA且預示著不利的預后生存。在本章節(jié),我們將在CD34+細胞和MDS細胞系上研究PcG蛋白BMI1與MDS克隆細胞增殖和凋亡的關系,探討其在克隆細胞凋亡增殖轉換中的作用。
　　材料與方法:采用實時熒光定量PCR和流式細胞術檢測34例MDS患者骨髓CD34+細胞BMI1 mRNA/蛋白表達和細胞凋亡;構建BMI1的真

19、核基因表達質粒和siRNA干擾體系,采用Annexin V法、MTT法和7-AAD標記研究BMI1過表達或低表達對MDS來源的細胞系MDS-L的凋亡、增殖和細胞周期的影響,采用免疫印跡檢測BMI1下游蛋白的表達來研究其效應機制;最后,在不同的細胞毒藥物作用下,評估BM1過表達或低表達的MDS-L細胞對這些藥物的凋亡敏感性。
　　結果:①與正常對照相比,高危MDS患者CD34+細胞高表達BMI1 mRNA和蛋白,低危MDS患者并無B

20、MI1的明顯高表達;MDSCD34+細胞凋亡與BMI1表達呈現(xiàn)明顯的反相關。②MDS患者存在明顯異常的增殖凋亡比,高危MDS患者BMI1/p53比值明顯增高;盡管低危MDS伴隨有p53的高表達,BMI1/p53比值也顯著高于正常對照。③過表達BMI1的MDS-L細胞呈現(xiàn)更強的增殖活力,細胞的自身凋亡也明顯受抑;而BMI1沉默后的MDS-L細胞則呈現(xiàn)明顯受抑的增殖和增高的凋亡。細胞周期分析顯示過表達BMI1的MDS-L細胞呈現(xiàn)增加的S期細

21、胞,而BMI1的沉默導致明顯的G1期阻滯。④BMI1的過表達明顯抑制p16INK4A、phos-p53(ser46)表達和Caspase3/9等凋亡蛋白的剪切,而BMI1的沉默能夠增強p16INK4A、phos-p53(ser46)、bax表達和和Caspase3/9等凋亡蛋白的剪切。⑤BMI1的沉默增強TNF-alpha和TRAIL誘導的MDS-L細胞凋亡。BMI1過表達的MDS-L細胞耐受AZA和DAC的毒性:而BMI1被抑制后,A

22、ZA和DAC誘導的凋亡明顯增加。⑥與低表達BMI1的患者相比,高表達BMI1的患者IPSS預后積分增高,生存時間縮短。
　　結論:①MDS克隆細胞通過BMI1的過表達抑制多種凋亡蛋白,抑制細胞凋亡和促進增殖,誘導克隆細胞產生凋亡抵抗和藥物耐受,從而維持惡性生物學特征。②BMI1可能作為一個潛在的治療靶點,其表觀遺傳學作用機制有待進一步研究。
　　第五章 PcG蛋白EZH2在MDS表觀遺傳學發(fā)病中作用的初步研究
　　目的

23、:PcG蛋白EZH2在組蛋白H3K27甲基化介導的基因轉錄沉默中發(fā)揮關鍵作用,然而其在MDS中的作用尚無研究。在本章節(jié),我們初步研究MDS患者PcG蛋白EZH2的基因功能定位及過表達的發(fā)生機制,為進一步深入研究EZH2在MDS表觀遺傳學發(fā)病中作用奠定基礎。
　　材料與方法:采用實時熒光定量PCR和流式細胞術檢測34例MDS患者骨髓CD34+細胞EZH2 mRNA/蛋白表達和和細胞凋亡:采用Agilent miRNAs微陣列分析獲取

24、MDS患者和正常對照CD34+細胞miRNAs譜的差異性表達,分析靶向EZH2 miRNAs的表達狀況;采用基于Taqman miRNAs檢測的熒光定量PCR驗證靶向EZH2的miRNAs表達狀況;采用定量PCR在MDS細胞系和多個AML細胞系中檢測EZH2表達和相應的靶向miRNA表達。綜合分析EZH2表達和相應miRNAs表達的關系。
　　結果:①與正常對照相比,低危MDS和高危MDS患者CD34+細胞均高表達EZH2 mRN

25、A和蛋白,在MDS和AML細胞系也得到類似的結果;EZH2蛋白表達與BMI1蛋白表達明顯呈正相關,但與MDS CD34+細胞凋亡呈反相關;②來自于正常人和MDS患者CD34+細胞的microRNAs表達譜分析顯示靶向EZH2的microRNAs包括miR-26a,miR-98,miR-101和let-7a表達下調。③定量PCR驗證分析顯示與正常對照相比,MDS患者中miR-101和miR-26a表達明顯下調,而let-7a和miR-98

26、表達無明顯變化。④靶向EZH2的miRNA表達與EZH2 mRNA表達相關性分析顯示miR-101和miR-26a的表達與EZH2 mRNA表達呈現(xiàn)明顯的反相關,miR-101和miR-26a的下調是導致了EZH2的過表達的一個重要因素。⑤MDS和白血病細胞系靶向EZH2的miRNA分析顯示MDS-L細胞和KG1a細胞miR-101和miR-26a表達明顯下調,而結果①顯示在MDS-L和KG1a細胞中EZH2的表達最高。
　　結論