大鼠肝細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞混合共微囊化的體外功能研究.pdf

1、目的：本研究試將大鼠肝細(xì)胞(Hepatocytes)和同源的睪丸支持細(xì)胞(Sertolicells，SCs)混合培養(yǎng)后進(jìn)行共微囊化(Co-microencapsulation)，觀察肝細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞混合共微囊化對(duì)肝細(xì)胞生物學(xué)活性的支持作用。 方法：利用微囊發(fā)生器制備含肝細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞及兩者混合細(xì)胞的微囊，首先，摸索兩種細(xì)胞的最佳混合比；然后根據(jù)微囊內(nèi)包裹細(xì)胞種類的不同，分為微囊化肝細(xì)胞組，微囊化睪丸支持細(xì)胞組，肝細(xì)胞、睪

2、丸支持細(xì)胞分別微囊后共同培養(yǎng)組和肝細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞混合共微囊組。觀察囊內(nèi)細(xì)胞形態(tài)，體外培養(yǎng)測(cè)定培養(yǎng)液中Alb與尿素的分泌，判斷各組囊內(nèi)肝細(xì)胞活性和功能。樣本比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的多元方差分析。 結(jié)果： (1)包裹混合細(xì)胞的微囊呈球形，表面光滑，直徑600～800μm，細(xì)胞懸浮于囊內(nèi)，每個(gè)微囊含150～200個(gè)細(xì)胞。 (2)體外培養(yǎng)96h時(shí)，光學(xué)顯微鏡下見(jiàn)微囊仍呈球形，表面光滑；細(xì)胞均勻散在分布于微囊內(nèi)，數(shù)量無(wú)明

3、顯變化；囊內(nèi)肝細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞呈圓形，而在體外培養(yǎng)的非微囊包裹的睪丸支持細(xì)胞則較快地貼壁并呈梭形生長(zhǎng)。 (3)純化后的肝細(xì)胞濃度為90％，睪丸支持細(xì)胞濃度為85％。 (4)與純肝細(xì)胞微囊組相比，一定比例的睪丸支持細(xì)胞可促進(jìn)共微囊化肝細(xì)胞的Alb分泌和尿素合成(P＜0.01)，肝細(xì)胞存活時(shí)間也相應(yīng)延長(zhǎng)。 (5)肝細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞以20:1比例混合時(shí)即能達(dá)到最佳效果。 (6)微囊化睪丸支持細(xì)胞組培養(yǎng)液上清

4、中無(wú)法檢測(cè)出Alb與尿素。 (7)與微囊化肝細(xì)胞組相比，肝細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞分別微囊后共同培養(yǎng)組與肝細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞混合共微囊組肝細(xì)胞的存活時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)液上清中Alb分泌(F=217.56，P＜0.001)和尿素合成量(F=232.72，P＜0.001)明顯增加。 (8)混合細(xì)胞共微囊組于培養(yǎng)第7天Alb與尿素含量最高(分別為2.80±0.11mg/ml，1.92±0.10μmol/L)，而其它兩組均于培養(yǎng)第3天Al

5、b與尿素含量達(dá)到最高(2.48±0.08mg/ml，1.47±0.08μmol/L；2.27±0.10mg/ml，1.37±0.05μmol/L)。 (9)相對(duì)于肝細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞混合共微囊組，肝細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞分別微囊后共同培養(yǎng)組在培養(yǎng)后期Alb、尿素含量下降趨勢(shì)更明顯。 結(jié)論： 1.采用胰酶+EDTA法分離肝細(xì)胞，可獲得較高產(chǎn)量和活力的肝細(xì)胞，與膠原酶分離法相比，大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本。 2.采用膠原

6、酶+胰酶法分離睪丸支持細(xì)胞，可獲得較高純度和數(shù)量的睪丸支持細(xì)胞。 3.肝細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞以20:1進(jìn)行混合，可最大程度發(fā)揮肝細(xì)胞的功能。 4.微囊化睪丸支持細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組無(wú)法檢測(cè)出Alb與尿素，說(shuō)明睪丸支持細(xì)胞本身并不分泌Alb與尿素，將其設(shè)為參照組，更能排除可能由睪丸支持細(xì)胞帶來(lái)的影響。 5.肝細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞混合共微囊組Alb分泌和尿素合成量明顯高于其他兩組，提示睪丸支持細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞有重要的支持、營(yíng)養(yǎng)作用