同型半胱氨酸對人血管平滑肌細胞生物學(xué)特性影響及其作用機制的實驗研究.pdf

1、第一部分人臍動脈血管平滑肌細胞培養(yǎng)與鑒定 目的：建立人臍動脈血管平滑肌細胞(VSMCs)體外培養(yǎng)模型。 方法：運用改良的植塊貼壁法體外培養(yǎng)VSMCs；在倒置顯微鏡下進行細胞形態(tài)學(xué)觀察并對培養(yǎng)的細胞進行α-actin免疫組化鑒定。 結(jié)果：培養(yǎng)的細胞生長良好，光鏡下呈長梭形及“峰與谷”樣生長。α-actin免疫組化的結(jié)果顯示培養(yǎng)的細胞具有典型的VSMCs特征。 結(jié)論：改良植塊貼壁法能使VSMCs原代培養(yǎng)的時間

2、明顯縮短，傳代后VSMCs生物學(xué)特征的穩(wěn)定性好，成功建立了人血管平滑肌細胞(VSMCs)體外培養(yǎng)模型。 第二部分同型半胱氨酸對人血管平滑肌細胞增殖、細胞周期分布及cyclinA、cyclinB1表達影響 目的：觀察同型半胱氨酸(Hcy)對人臍動脈血管平滑肌細胞(VSMCs)增殖的影響，并探討其機制。 方法：采用MTT方法檢測Hcy誘導(dǎo)VSMCs增殖情況；采用流式細胞儀檢測細胞周期；采用RT-PCR方法檢測細胞周

3、期蛋白A(cyclinA)和細胞周期蛋白B1(cyclinB1)mRNA的表達。 結(jié)果：1、體外培養(yǎng)的人臍動脈VSMCs在終濃度為100、200、500、1000μmol/LHcy的培養(yǎng)液中孵育24h后的A值均高于對照組(P＜0.05)，表明Hcy呈濃度依賴性誘導(dǎo)人VSMCs增殖； 2、體外培養(yǎng)的人臍動脈VSMCs在終濃度為0(對照組)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培養(yǎng)液中孵育24h后的S期細胞百

4、分數(shù)分別為12.2％、17.0％、24.2％、32.8％、41.4％，表明Hcy能增加VSMCsS期細胞百分數(shù)； 3、體外培養(yǎng)的人VSMCs在終濃度為0(對照組)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培養(yǎng)液中孵育24h后的cyclinAmRNA相對表達量分別為0.66±0.01、0.79±0.04、0.87±0.02、1.07±0.03和1.18±0.04，cyclinB1mRNA相對表達量分別為0.55±0.0

5、2、0.68±0.02、0.89±0.05、1.28±0.01和1.41±0.02，表明Hcy呈濃度依賴性顯著誘導(dǎo)人VSMCscyclinA和cyclinB1基因的表達。 結(jié)論：1、Hcy可以誘導(dǎo)人臍動脈VSMCs增殖，而且呈濃度依賴性； 2、Hcy誘導(dǎo)人臍動脈VSMCs增殖，使S期VSMCs細胞百分數(shù)增加，可能與其誘導(dǎo)cyclinA和cyclinB1基因表達有關(guān)。 第三部分同型半胱氨酸誘導(dǎo)人血管平滑肌細胞凋亡

6、及其機制探討 目的：研究同型半胱氨酸(Hcy)對人臍動脈血管平滑肌細胞(VSMCs)凋亡的影響，并探討其機制。 方法：用透射電鏡觀察經(jīng)Hcy誘導(dǎo)人臍動脈VSMCs凋亡的形態(tài)學(xué)改變；用瓊脂糖凝膠電泳測定DNAladder；采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率；采用RT-PCR檢測bcl-2、bax及caspase-3mRNA表達變化。 結(jié)果：1、200-1000μmol/L濃度Hcy能明顯誘導(dǎo)人臍動脈VSMCs凋亡，產(chǎn)生凋

7、亡細胞所具有的典型形態(tài)學(xué)及生化特征； 2、體外培養(yǎng)的人臍動脈VSMCs在終濃度為0(對照組)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培養(yǎng)液中孵育24h后的細胞凋亡率分別2.68％±0.23％、2.79％±0.12％、8.45％±2.41％、13.37％±4.71％、23.75％±5.56％，表明Hcy呈濃度依賴性誘導(dǎo)人VSMCs細胞凋亡； 3、體外培養(yǎng)的人臍動脈VSMCs在終濃度為0(對照組)、100、20

8、0、500、1000μmol/LHcy的培養(yǎng)液中孵育24h后的baxmRNA相對表達量分別為0.86±0.01、0.92±0.03、1.51±0.02、1.82±0.03、1.91±0.02，bcl-2mRNA相對表達量分別為1.38±0.04、1.32±0.03、1.28±0.03、1.21±0.02、1.09±0.02，表明Hcy呈濃度依賴性誘導(dǎo)人VSMCsbax基因表達顯著上調(diào)，bcl-2基因表達輕度下調(diào)，bax/bcl-2比值升

9、高； 4、體外培養(yǎng)的人臍動脈VSMCs在終濃度為0(對照組)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培養(yǎng)液中孵育24h后的caspase-3mRNA相對表達量分別為0.24±0.08、0.29±0.10、0.89±0.26、1.37±0.24、1.82±0.53，表明Hcy呈濃度依賴性誘導(dǎo)人VSMCscaspase-3基因表達顯著上調(diào)。 結(jié)論： 1、Hcy可誘導(dǎo)人VSMCs凋亡，其作用呈劑量相關(guān)性；

10、 2、Hcy誘導(dǎo)人VSMCs凋亡的機制可能是通過下調(diào)bcl-2基因表達及上調(diào)bax基因表達來實現(xiàn)的，此外，caspases-3也可能參與了細胞凋亡的調(diào)節(jié)。 第四部分同型半胱氨酸對人血管平滑肌細胞表達組織因子途徑抑制物-2的影響 目的：觀察同型半胱氨酸(Hcy)對人臍動脈血管平滑肌細胞(VSMCs)表達組織因子途徑抑制物-2(TFPI-2)的影響。 方法：采用RT-PCR方法檢測Hcy對人VSMCsTFP

11、I-2mRNA表達的變化；采用WesternBlot方法檢測Hcy對人VSMCsTFPI-2蛋白表達的變化。 結(jié)果：1、體外培養(yǎng)的人臍動脈VSMCs在終濃度為0(對照組)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培養(yǎng)液中孵育24h后的TFPI-2mRNA相對表達量分別為0.96±0.07、0.86±0.05、0.73±0.07、0.56±0.04和0.45±0.07，表明Hcy呈濃度依賴性抑制人VSMCsTFPI-2

12、基因的表達； 2、體外培養(yǎng)的人臍動脈VSMCs在終濃度為0(對照組)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培養(yǎng)液中孵育24h后的TFPI-2蛋白相對表達量分別為1.22±0.20、1.09±0.12、0.87±0.15、0.71±0.098和0.54±0.183，表明Hcy呈濃度依賴性抑制人VSMCsTFPI-2蛋白的表達。 結(jié)論：Hcy以濃度依賴性的方式抑制了人臍動脈VSMCs表達TFPI-2，提示Hc