iPS細(xì)胞分化的心臟前體細(xì)胞移植改善心梗小鼠心臟功能及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、無(wú)滋養(yǎng)細(xì)胞輔助的人脂肪干細(xì)胞重編程生成誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPS)
　　 目的：以人脂肪干細(xì)胞作為起始細(xì)胞，在無(wú)滋養(yǎng)細(xì)胞輔助條件下體外重編程生成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
　　 方法：從人脂肪組織中分離脂肪干細(xì)胞，通過(guò)慢病毒載體以四種轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染人脂肪干細(xì)胞；無(wú)滋養(yǎng)細(xì)胞輔助條件下將其體外重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，并以滋養(yǎng)細(xì)胞輔助的傳統(tǒng)重編程方法作為對(duì)照組，比較兩種方法重編程的效率；倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，分別取生長(zhǎng)狀態(tài)良

2、好的2-3代細(xì)胞傳入24孔培養(yǎng)板，XTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，并計(jì)數(shù)在不同時(shí)間點(diǎn)兩組細(xì)胞的數(shù)量以比較其增殖能力；重編程獲得的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞行堿性磷酸酶和免疫熒光染色進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定；體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞多能型；對(duì)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞基因組學(xué)進(jìn)行基因芯片（Microarray)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.將4種轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)慢病毒載體轉(zhuǎn)染人脂肪干細(xì)胞后，在無(wú)滋養(yǎng)細(xì)胞輔助條件下可將其重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。與傳統(tǒng)方法相比，使用人脂肪干

3、細(xì)胞作為起始細(xì)胞，在無(wú)滋養(yǎng)細(xì)胞輔助條件下的重編程效率明顯提高，且兩種方法所獲得的目的細(xì)胞的活性和增殖能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　 2.細(xì)胞表型鑒定結(jié)果顯示，目的細(xì)胞可表達(dá)多種胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞因子；
　　 3.體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)表明，目的細(xì)胞可分化為全部三個(gè)胚層的細(xì)胞，具有多向分化潛能；
　　 4.Microarray基因芯片結(jié)果顯示，人脂肪干細(xì)胞重編程生成的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有與人胚胎干細(xì)胞非常相似的基因表達(dá)圖譜。
　

4、　 結(jié)論：人脂肪干細(xì)胞不需滋養(yǎng)細(xì)胞輔助，即可在較短時(shí)間內(nèi)體外重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，并可代替成纖維細(xì)胞作為新的重編程起始細(xì)胞。
　　 第二部分、脂肪干細(xì)胞重編程誘導(dǎo)多能干細(xì)胞體外定向分化與報(bào)告基因轉(zhuǎn)染
　　 目的：將兩種報(bào)告基因轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞重編程的誘導(dǎo)干細(xì)胞，觀察其對(duì)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的影響；并研究誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的體外定向分化能力。
　　 方法：用慢病毒載體將兩種報(bào)告基因分別或共轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，含不同報(bào)告基因

5、的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分為A168H組，GFP-Fluc組和A168H-GFP-Fluc組，未轉(zhuǎn)染組設(shè)為陰性對(duì)照，倒置相差顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞形態(tài)，XTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，計(jì)數(shù)不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞的數(shù)目并比較其增殖能力；體外誘導(dǎo)各組細(xì)胞分化，行免疫熒光染色鑒定分化細(xì)胞表型；定向誘導(dǎo)各組細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，心肌細(xì)胞標(biāo)志物免疫熒光染色鑒定心肌細(xì)胞表型；體外生物發(fā)光成像技術(shù)檢測(cè)HSVl-A168Htk+/GFP-Fluc+細(xì)胞數(shù)量與信號(hào)強(qiáng)度關(guān)系。<

6、br>　　 結(jié)果：
　　 1.轉(zhuǎn)染不同報(bào)告基因的各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)與對(duì)照組無(wú)差異，細(xì)胞活性和增殖能力與對(duì)照組相似；
　　 2.體外多向分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞多向分化潛能無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；免疫熒光結(jié)果顯示，分化細(xì)胞可表達(dá)內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)記物AFP、Sox17，中胚層細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA或外胚層神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物Tuj-1;
　　 3.心肌細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化結(jié)果顯示，多能干細(xì)胞可在特定條件下分化為跳動(dòng)的心肌細(xì)胞；免疫熒光結(jié)果示，

7、分化細(xì)胞的心肌細(xì)胞標(biāo)記物α-actinin，c-TnT，nkx，mef2c均為陽(yáng)性表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)多能干細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)可分化為心肌細(xì)胞；
　　 4.體外生物發(fā)光成像結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)染報(bào)告基因HSVl-A168Htk+/GFP-Fluc+的細(xì)胞，其成像信號(hào)與細(xì)胞數(shù)量成正相關(guān)。
　　 結(jié)論：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可體外分化為全部三個(gè)胚層的細(xì)胞類型，而慢病毒載體介導(dǎo)的報(bào)告基因轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞無(wú)不良影響，成像信號(hào)與細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，可用來(lái)在體追蹤細(xì)

8、胞生存情況。
　　 第三部分、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心血管前體細(xì)胞移植改善心梗小鼠心臟功能及機(jī)制研究
　　 目的：觀察誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心血管前體細(xì)胞對(duì)心梗小鼠心臟功能的改善作用，并探討其作用機(jī)制。
　　 方法：體外誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化為心血管前體細(xì)胞，γ計(jì)數(shù)器和PET檢測(cè)報(bào)告探針體外吸收情況；建立免疫缺陷小鼠心梗模型，并隨機(jī)分為hASCs-iPS-CPC高劑量注射組（n=20只），hASCs-iPS-CPC低

9、劑量注射組（n=20只），PBS注射組(n=20只)，缺氧實(shí)驗(yàn)組(n=10)和缺氧對(duì)照組(n=10)。各組于注射細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)行PET、生物發(fā)光成像在體檢測(cè)移植細(xì)胞數(shù)量；術(shù)后第1、14、28天行超聲心動(dòng)圖、MRI掃描、PV loop以檢測(cè)各組小鼠心臟功能。術(shù)后28天斷頸處死各組小鼠，心臟標(biāo)本行H&E染色，免疫熒光和TUNEL染色。缺氧實(shí)驗(yàn)組每只小鼠左心室壁注射1X106個(gè)HSVl-A168Htk+/GFP-Fluc+CPC細(xì)胞，缺氧對(duì)

10、照組每只小鼠注射lx106個(gè)成纖維細(xì)胞，各組小鼠于術(shù)后3天處死，心臟標(biāo)本冰凍切片，激光顯微切割獲取移植細(xì)胞行細(xì)胞因子定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.Y計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)結(jié)果和PET成像結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HSVI-A168Htk報(bào)告基因的hASCs-iPS-CPC細(xì)胞對(duì)PET探針18F_FHBG的吸收隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，120分鐘左右達(dá)到最高值。
　　 2.術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別行PET掃描，結(jié)果顯示移植細(xì)

11、胞后的小鼠于術(shù)后第1天即可觀察到很強(qiáng)的心臟PET信號(hào)，隨著時(shí)間的推移，PET信號(hào)逐漸減弱，而PBS對(duì)照組小鼠則未發(fā)現(xiàn)PET信號(hào)。BLI成像也顯示了與PET相同的結(jié)果。
　　 3.心功能檢測(cè)顯示，各組小鼠術(shù)后第1天心功能均較前明顯下降，高劑量組術(shù)后第14天LVFS(P=0.0143)及LVEF（P=0.0354），術(shù)后28天LVFS（P=0.0284）及LVEF(P=O.0356)與低劑量組和PBS組相比均明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

12、意義。術(shù)后28天PV loop檢測(cè)結(jié)果示高劑量組ESV（P=0.0041）、EDV(P=0.0093)、ESP(P=O.O016)較低劑量組和PBS組顯著升高。
　　 4.不同時(shí)間點(diǎn)的LVFS與第一天PET信號(hào)結(jié)果聯(lián)合分析顯示，術(shù)后28天心功能與PET信號(hào)之間存在較明顯的相關(guān)性（R2=0.72）。
　　 5.各組小鼠心臟標(biāo)本H&E染色結(jié)果示，高劑量組左心室壁厚度較低劑量組和PBS組明顯增加。免疫熒光染色結(jié)果示，高劑量組左