內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管周毛細(xì)血管重建的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的:
　　 慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)是世界范圍內(nèi)的健康問題,最終不可逆地發(fā)展為終末期腎衰(end stage renal failure,ESRF)。目前終末期腎衰的臨床治療主要依靠替代治療或腎移植,但透析治療病人有著相當(dāng)高的死亡率和大量并發(fā)癥,而且由于供體的缺乏及移植后昂貴的免疫抑制劑,腎移植的應(yīng)用也受到了限制。因此探討更為有效的慢性腎臟病的防治方法,抑制慢性腎臟病進(jìn)展和促進(jìn)腎

2、組織修復(fù)已成為腎臟病研究的重要領(lǐng)域。
　　 近年研究發(fā)現(xiàn)CKD進(jìn)展的最終共同通路是小管間質(zhì)纖維化,CKD患者腎功能不全更大程度上與小管間質(zhì)纖維化程度相關(guān)。大量的研究證實(shí)腎小管周毛細(xì)血管的丟失和低氧是小管間質(zhì)損傷纖維化的最終共同通路,而前者是低氧的主要原因之一。低氧導(dǎo)致腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡,并促進(jìn)致纖維化因子、炎癥因子等分泌。還有研究發(fā)現(xiàn)血管損傷最易導(dǎo)致血管周細(xì)胞移動(dòng)和分化成肌成纖維細(xì)胞,提出對(duì)纖維化的研究重點(diǎn)應(yīng)該是血管,而不僅僅是上皮

3、細(xì)胞。故通過改善腎小管周微血管的密度,改善缺氧,延緩甚至逆轉(zhuǎn)CKD的進(jìn)展具有重要意義。
　　 血管的生成一般認(rèn)為是通過成熟內(nèi)皮細(xì)胞增生、移動(dòng),以出芽方式完成,稱為血管生成(angiogenesis),而另外還有一種生成血管的機(jī)制是通過內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitor cells,EPCs)分化形成血管,稱為血管發(fā)生(vasculogenesis)。后者通常被認(rèn)為僅僅存在于胚胎血管形成。自從1997年Asah

4、ara及同事成功分離出外周血中EPCs后,這種觀點(diǎn)已得到改變。EPCs是一類能循環(huán)、增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞,但尚未表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型,也未形成血管的前體細(xì)胞。EPCs在心腦血管和外周血管重建方面得到了廣泛的研究。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞不僅能直接增殖、分化為內(nèi)皮細(xì)胞,參與形成新的血管結(jié)構(gòu),還能分泌許多生長因子,如血管內(nèi)皮生長因子(Vascularendothelial growth factor,VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(F

5、ibroblast growth factor,bFGF);分泌一些生物活性物質(zhì)如NO,影響內(nèi)皮功能;通過自分泌和旁分泌的方式參與內(nèi)皮修復(fù)?？梢?內(nèi)皮祖細(xì)胞在成體參與血管修復(fù)過程中是以一種類似于胚胎血管發(fā)生的方式進(jìn)行,強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞因子和細(xì)胞的協(xié)同作用,因而形成更加完整成熟的血管。
　　 已有的研究發(fā)現(xiàn)在CKD早在第1期就存在EPCs數(shù)量和功能的減少,而腎移植后有所改善,還有研究發(fā)現(xiàn)骨髓源的EPCs能修復(fù)腎小球毛細(xì)血管。既然CKD存

6、在EPCs數(shù)量和功能的減少,那么通過EPCs移植是否就能重建腎小管周毛細(xì)血管,從而改善由于低氧導(dǎo)致的CKD進(jìn)行性惡化呢?其可能的機(jī)制又如何呢?為此,本研究首先在體外觀察了低氧刺激腎小管上皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)液對(duì)體外擴(kuò)增的EPCs增殖、遷移和分泌血管生成因子的影響;然后在動(dòng)物體內(nèi)觀察了EPCs移植對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠的腎小管周毛細(xì)血管密度和小管間質(zhì)纖維化的改善和可能的機(jī)制;作為參與缺血誘導(dǎo)EPCs動(dòng)員的最重要和最終的趨化因子--基質(zhì)細(xì)胞衍生因

7、子(Stromal cell derived factor-1,SDF-1)是否也參與了EPCs在腎間質(zhì)的歸巢。
　　 方法:
　　 本課題第一部分采用內(nèi)皮祖細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化密度梯度離心法獲得的大鼠骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞,以獲得大鼠骨髓源性EPCs,并通過攝取acLDL-DiI和結(jié)合FITC-lectin熒光雙染、免疫熒光檢測細(xì)胞表面干細(xì)胞抗原及內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原鑒定。采用組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞,低

8、氧處理腎小管上皮細(xì)胞后獲得條件培養(yǎng)液(Conditioned medium,CM),常氧處理后獲得的條件培養(yǎng)液作為對(duì)照組,采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和westernblot檢測低氧刺激后腎小管上皮細(xì)胞SDF-1和VEGF的表達(dá)。經(jīng)CM處理大鼠骨髓源EPCs后,采用MTT分析其增殖、遷移能力,采用RT-PCR和Western blo

9、t檢測CM作用后EPCs分泌VEGF、血管生成素-1(angiogenin-1,Ang-1),表達(dá)C-X-C家族趨化因子受體(C-X-C chemokine receptor,CXCR4)的變化。
　　 本課題第二部分采用單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral reteral obstruction,UUO)間質(zhì)纖維化模型,體外擴(kuò)增并標(biāo)記EPCs后移植。分組如下:
　　 1.假手術(shù)對(duì)照組(Sham operationgro

10、up):簡稱為Sham組,n=15只。手術(shù)入路方式同UUO組,進(jìn)腹腔后分離左輸尿管但不結(jié)扎輸尿管。術(shù)中經(jīng)左腎動(dòng)脈注射0.01mol/L PBS1ml。
　　 2.移植對(duì)照組(transplantation control group):簡稱sham+EPCs組,n=15只。手術(shù)入路方式同UUO組,進(jìn)腹腔后分離左輸尿管但不結(jié)扎輸尿管。術(shù)中經(jīng)左腎動(dòng)脈注射0.01mol/L PBS1ml稀釋EPCs107個(gè)。
　　 3.單側(cè)輸

11、尿管梗阻組(Ulateral ureteral obstruction group):簡稱為UUO組,n=15只。大鼠行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)。術(shù)中經(jīng)左腎動(dòng)脈注射0.01mol/L PBS1ml。
　　 4.移植組(Transplantation group):UUO+EPCs,n=15只。大鼠行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù),術(shù)中經(jīng)左腎動(dòng)脈注射0.01mol/L PBS1ml稀釋的同窩來源EPCs107個(gè)。
　　 7d,14d,21d,每

12、組隨機(jī)抽取5只動(dòng)物處死,采集尿液、血液及腎臟組織標(biāo)本,觀察不同時(shí)間點(diǎn)以下指標(biāo)的變化:①檢測腎重/體重、24小時(shí)尿蛋白定量以及血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐水平。②HE、PAS和Masson染色后在光鏡下觀察腎組織形態(tài)改變,并進(jìn)行小管間質(zhì)病變的病理損害積分。③免疫組織化學(xué)檢測腎小管周毛細(xì)血管密度(JG12)和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、SDF-1、VEGF、α

13、-SMA、HIF-1α的表達(dá),采用western blot檢測SDF-1、VEGF和HIF-1α、Ang-1的表達(dá)。④采用熒光雙染對(duì)移植細(xì)胞定位,免疫熒光法檢測移植細(xì)胞的半定量。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:內(nèi)皮祖細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞在7～10天呈梭形或紡錘形,類似于內(nèi)皮細(xì)胞,絕大多數(shù)細(xì)胞可攝取acLDL-DiI,能結(jié)合FITC-lectin,免疫熒光檢測到既有干細(xì)胞抗原CD133、CD34,又有

14、內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物VEGFR-2表達(dá)。組織塊貼壁法培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞,在貼壁后24～48h腎小管節(jié)段周有上皮樣細(xì)胞長出,6～7天鋪滿瓶底,形態(tài)為多邊鵝卵石樣,免疫熒光角蛋白染色陽性。低氧作用腎小管上皮細(xì)胞48h后SDF-1和VEGF表達(dá)均有增加,5％氧濃度增加最為明顯。CM刺激EPCs后,EPCs增殖、遷移能力增強(qiáng)(P＜0.05),VEGF、Ang-1和CXCR4表達(dá)顯著強(qiáng)于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 第二部分:成功構(gòu)建了

15、大鼠UUO模型,隨梗阻時(shí)間延長,梗阻側(cè)腎臟體積逐漸增大,腎盂內(nèi)積液增加,腎實(shí)質(zhì)變薄,鏡下第7天可見明顯的腎小管擴(kuò)張、上皮細(xì)胞空泡變性、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤;第14天腎小管擴(kuò)張更加明顯,上皮細(xì)胞有萎縮,有纖維化形成。
　　 結(jié)論:
　　 1.采用內(nèi)皮祖細(xì)胞選擇性培養(yǎng)液培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化密度梯度離心法獲得的骨髓單個(gè)核細(xì)胞,成功培養(yǎng)出了大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　 2.采用組織塊貼壁法,成功培養(yǎng)了腎小管上皮細(xì)胞。
　　

16、3.低氧作用下腎小管上皮細(xì)胞VEGF和SDF-1表達(dá)增加;低氧作用腎小管的條件培養(yǎng)液(CM)促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移和VEGF、Ang-1、CXCR4表達(dá),提示CM通過VEGF和SDF-1促進(jìn)了內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移、生存和成血管能力。
　　 4.EPCs移植改善了UUO大鼠梗阻腎臟的腎小管周毛細(xì)血管密度和小管間質(zhì)損傷;
　　 5.UUO大鼠有SDF-1表達(dá),提示其能促進(jìn)EPCs歸巢,歸巢的EPCs參與了間質(zhì)血管的重建;