原白頭翁素衍生物體外誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的：探討原白頭翁素衍生物對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株的抗增殖和誘導(dǎo)凋亡作用及其機(jī)制，為開發(fā)抗腫瘤中藥提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　方法：采用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞；應(yīng)用MTT法測定原白頭翁素衍生物對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株的抗增殖及細(xì)胞毒性作用；應(yīng)用倒置顯微鏡、HE染色光鏡觀察法、吖碇橙（AO）/溴化乙啶（EB）雙染色熒光顯微鏡觀察法、掃描電鏡（SEM）來觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的變化；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（FCM

2、）分析細(xì)胞周期分布和凋亡情況；應(yīng)用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測藥物作用前后細(xì)胞增殖核抗原Ki-67，凋亡通路相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Fas，凋亡蛋白激酶Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9，凋亡抑制蛋白Livin、Survivin以及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)變化并深入探討原白頭翁素衍生物對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　?。?）MTT法

3、檢測結(jié)果表明：1μg/ml-20μg/ml原白頭翁素衍生物（Br-、I-、OAC-）對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株均有明顯抑制作用，且呈現(xiàn)出濃度和時間依賴性，其中以Br基取代的衍生物抑制作用最強(qiáng)；
　?。?）形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞體積變小變圓，核染色質(zhì)凝集，細(xì)胞間連接疏松，貼壁能力減弱；HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞質(zhì)脫水濃縮，伊紅染色增強(qiáng)，可見凋亡小體等典型的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮，微絨

4、毛結(jié)構(gòu)減少甚至消失；AO/EB熒光雙染色法觀察到了實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞有類似活細(xì)胞的正常核，但染色質(zhì)為橙紅色，壞死細(xì)胞顯示橙紅色的濃縮，染色質(zhì)碎裂；
　?。?）流式細(xì)胞儀分析結(jié)果：5μg/ml藥物作用24、48、72h后，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡峰，且S期細(xì)胞明顯增多，而G1期細(xì)胞明顯減少，多數(shù)細(xì)胞阻滯在S期；
　?。?）TUNEL染色法檢測結(jié)果顯示：5μg/ml藥物作用24、48、72h后均能誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡，藥物作用48

5、h后的凋亡率與24h實(shí)驗(yàn)組相比明顯增高，而72h的凋亡率下降，實(shí)驗(yàn)組與對照組凋亡率相比均有統(tǒng)計學(xué)意義；
　?。?）免疫細(xì)胞化學(xué)（SABC法）檢測法發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Fas和Bax的表達(dá)增加，Bcl-2、Ki-67、Livin、Survivin和NF-κB表達(dá)降低，與對照組相比較均有顯著差異。
　　結(jié)論：
　　1、原白頭翁素衍生物（Br-、I-、OAC-）對人乳腺癌