鴨疫里默氏桿菌脂多糖單克隆抗體制備、突變株篩選及生物學(xué)特性研究.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）感染能造成雛鴨高死亡率，給世界各國養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大損失。本研究成功制備了RA脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)單克隆抗體，并用于對RALPS突變株篩選、鑒定及其生物學(xué)特性分析。共篩選獲得2株LPS突變株，并對突變株的免疫效果作了評估。本研究結(jié)果表明完整的LPS結(jié)構(gòu)對RA的毒力是必需的。本研究包括以下3部分內(nèi)容:
　　本試驗旨在研制鴨疫里默氏桿

2、菌脂多糖(LPS)單克隆抗體。將鴨疫里默氏桿菌CH3作為免疫原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過3次免疫后，取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，將熱酚水法抽提的CH3 LPS作為包被抗原，利用間接ELISA篩選陽性細(xì)胞株并進(jìn)行3次亞克隆后制備小鼠腹水單克隆抗體。共獲得2株穩(wěn)定分泌鴨疫里默氏桿菌CH3 LPS單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為7H1和8A9。2株單克隆抗體均為IgG1亞類。腹水單克隆抗體ELISA效價分別為1∶1

3、2800和1∶6400。應(yīng)用玻片凝集試驗和懸浮熒光試驗檢測2株單克隆抗體與國內(nèi)流行血清型1、2和10型鴨疫里默氏桿菌菌株的反應(yīng)性，結(jié)果表明2株單抗與血清1型菌株WJ4發(fā)生特異性反應(yīng)，而與鴨疫里默氏桿菌血清2型菌株NJ-3及血清10型菌株HXb2無反應(yīng)性。本研究成功制備了穩(wěn)定性好、特異性強的LPS單克隆抗體，為篩選RALPS缺失株和分析RALPS的結(jié)構(gòu)提供了保障。
　　本研究中，用RALPS單抗8A9篩選RA轉(zhuǎn)座子隨機突變庫，獲得突

4、變株CH3ΔM949_1556，間接ELISA試驗表明該突變株與單抗8A9呈陰性反應(yīng)。動物試驗表明該突變株半數(shù)致死量(LD50)大于1010CFU，較野生株CH3(LD50=2×108)減毒50倍以上。突變株CH3ΔM9491556感染雛鴨血液載菌量與野生株感染雛鴨相比顯著下降。突變株CH3ΔM949_1556對于體外補體介導(dǎo)的殺菌作用較CH3更敏感。另外，CH3ΔM949_1556對Vero細(xì)胞的粘附、入侵能力增強。CH3ΔM949_

5、1556油乳劑滅活苗免疫雛鴨后能對RA血清1型(WJ4)、血清2型(Yb2)及血清10型(HXb2)菌株產(chǎn)生較強的保護(hù)力，證明突變株CH3ΔM949_1556能對RA血清1、2、10型產(chǎn)生廣譜保護(hù)作用。試驗結(jié)果表明M9491556基因與RA的抗原性和致病性相關(guān)。
　　本研究中，用RALPS單抗8A9篩選RA轉(zhuǎn)座子隨機突變庫，獲得突變株RA-M1，對其鑒定后發(fā)現(xiàn)突變基因是編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的M949_1603基因。基因分布檢測表明該基因

6、為RA血清1型菌株所特有。間接ELISA試驗中該突變株不與脂多糖單抗8A9反應(yīng)。與抗RA CH3兔血清進(jìn)行Western blotting試驗，結(jié)果顯示RA-M1LPS與CH3 LPS相比，代表LPS O抗原部分的梯狀條帶出現(xiàn)了缺失現(xiàn)象。與野生株CH3相比，RA-M1毒力顯著下降、對血清殺菌更敏感。另外，我們對RA-M1滅活疫苗的交叉保護(hù)效果進(jìn)行了評估。二次免疫后對血清1型(WJ4)、血清2型(Yb2)和血清10型（HXb2）強毒攻擊產(chǎn)