iASPP調(diào)控頭頸鱗癌生長(zhǎng)增殖、侵襲及化療敏感性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、全球每年大約有50多萬(wàn)頭頸鱗癌(Head and Neck SquamousCell Carcinoma，HNSCC)的新發(fā)患者，而每年全球因頭頸鱗癌而死亡的患者達(dá)20萬(wàn)左右[1，2]。目前，頭頸鱗癌的治療方式主要以手術(shù)治療為主，放療、化療及分子靶向治療等其他治療方式為輔[3]。盡管各種治療手段都在不斷的更新和進(jìn)步，但是頭頸鱗癌患者的五年生存率并沒(méi)有因此而得到顯著的提高，依然嚴(yán)重危害著人類(lèi)的健康和生命[4]。那么，是什么因素促進(jìn)了頭頸鱗

2、癌的發(fā)生發(fā)展，并使現(xiàn)有的治療方式陷入窘境？目前認(rèn)為和多種實(shí)體瘤一樣，頭頸鱗癌在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中歷經(jīng)了一系列的基因改變，因此，從分子基因水平研究頭頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，并尋找該過(guò)程中起關(guān)鍵作用的調(diào)控因子，從而進(jìn)行針對(duì)性的預(yù)防、干預(yù)和控制，是早期診斷及有效預(yù)防和治療頭頸鱗癌的關(guān)鍵[5，6]。
　　iASPP(inhibitory member of the ASPPfamily)是 ASPP(ankyrin-repeat, SH3-do

3、main and prolinerichdomain protein)即P53凋亡刺激蛋白(apoptosis stimulating protein of P53)家族中的抑制成員，它能競(jìng)爭(zhēng)性地與P53結(jié)合，抑制P53的抑癌功能，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的癌蛋白。目前研究表明，iASPP在乳腺癌[7]、白血病[8]、肝癌[9]、卵巢癌[10]等多種惡性腫瘤中表達(dá)升高，它通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而，迄今為

4、止，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)iASPP在頭頸鱗癌中的報(bào)道，因此，本研究擬探討其在頭頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用及對(duì)化療敏感性的影響。
　　第一章、iASPP在頭頸鱗癌中的表達(dá)及其臨床意義
　　目的:檢測(cè)iASPP mRNA及蛋白在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（頭頸鱗癌）組織及細(xì)胞株中的表達(dá)，并探討其表達(dá)與頭頸鱗癌患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。
　　方法:采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)iASPP蛋白在109例頭頸鱗癌石蠟組織標(biāo)本和15例癌旁組織標(biāo)本中的

5、表達(dá)，并統(tǒng)計(jì)分析iASPP蛋白的表達(dá)與頭頸鱗癌患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系;同時(shí)，運(yùn)用熒光定量RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)iASPP mRNA及蛋白在16例配對(duì)頭頸鱗癌組織及癌旁粘膜組織中的表達(dá);此外還采用Western blot方法檢測(cè)iASPP蛋白在7株頭頸鱗癌細(xì)胞株和人口腔粘膜癌前病變細(xì)胞株DOK中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:iASPP蛋白在頭頸鱗癌組織及細(xì)胞株中的表達(dá)均上調(diào)，且iASPP蛋白在腫瘤細(xì)胞胞漿

6、和胞核中均有表達(dá)。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析表明胞漿iASPP蛋白和胞核iASPP蛋白的表達(dá)與頭頸鱗癌患者的T分級(jí)（T1+T2/T3+T4）(P=0.002，P=0.033)、臨床分期（Ⅰ期+Ⅱ期/Ⅲ期+Ⅳ期）(P＜0.001，P=0.004)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001，P＜0.001)及復(fù)發(fā)（兩者均P＜0.001）密切相關(guān);Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示iASPP高表達(dá)組與低表達(dá)組的5年無(wú)病生存率及5年總生存率之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、（P均＜0.001）;多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)一步表明，胞漿iASPP蛋白的表達(dá)水平是頭頸鱗癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P＜0.05)。同時(shí)，熒光定量RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示iASPPmRNA及蛋白在頭頸鱗癌組織的表達(dá)顯著高于其在癌旁粘膜中的表達(dá)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，P=0.002)。
　　結(jié)論:iASPP在頭頸鱗癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高，且其高表達(dá)與頭頸鱗癌患者的T分級(jí)、臨床分期、淋巴

8、結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后密切相關(guān)。這些結(jié)果均提示iASPP可能在頭頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，并且有望成為早期診斷和評(píng)估頭頸鱗癌患者預(yù)后的重要分子標(biāo)志物。
　　第二章、沉默iASPP基因的表達(dá)對(duì)頭頸鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、凋亡、周期和侵襲能力的影響
　　目的:觀察沉默iASPP基因表達(dá)后，對(duì)頭頸鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、凋亡、周期及侵襲能力等生物學(xué)行為的影響。
　　方法:采用慢病毒介導(dǎo)的iASPP shRNA感染頭頸鱗癌Tu68

9、6細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選并建立穩(wěn)定沉默iASPP基因的Tu686細(xì)胞，熒光定量RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)iASPP基因的沉默效果;采用CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默iASPP基因表達(dá)后，對(duì)頭頸鱗癌Tu686細(xì)胞的體外生長(zhǎng)增殖能力、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布及侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.慢病毒介導(dǎo)的iASPP shRNA有效地抑制了頭頸鱗癌Tu686細(xì)胞中iASPP基因的表

10、達(dá)，并成功建立了穩(wěn)定沉默iASPP基因的Tu686細(xì)胞。
　　2.CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示iASPP基因沉默后能顯著抑制Tu686細(xì)胞的體外增殖能力。自72h時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始(72h、96h、120h)LV-shiASPP細(xì)胞（穩(wěn)定表達(dá)iASPP shRNA基因片段的Tu686細(xì)胞）的OD值顯著低于對(duì)照組UT細(xì)胞（未處理的Tu686親本細(xì)胞）和LV-shNon細(xì)胞（穩(wěn)定表達(dá)Control shRNA基因片段的Tu686細(xì)胞）的OD值(P均

11、＜0.01)。而在每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)上UT細(xì)胞和LV-shNon細(xì)胞的OD值間相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示沉默iASPP基因表達(dá)后，LV-shiASPP細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組UT和LV-shNon細(xì)胞明顯增多（9.42±0.39％ vs2.80±0.42％，3.18±0.28％），其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)LV-shiASPP細(xì)胞中處于G0/G1期的細(xì)胞比例較對(duì)照組UT和LV

12、-shNon細(xì)胞顯著增多（74.65±1.09％ vs55.19±1.02％，54.62±0.88％）(P＜0.01)，而處于S期（17.54±1.21％ vs32.56±0.98％，32.50±1.17％）(P＜0.01)和G2/M期(7.81±0.76％ vs12.24±0.68％，12.87±0.31％)(P＜0.01)的細(xì)胞比例顯著減少，而UT和LV-shNon兩對(duì)照組細(xì)胞之間的周期分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　

13、4.沉默iASPP基因表達(dá)后，Tu686的侵襲能力顯著減弱。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示48小時(shí)后穿過(guò)Transwell侵襲小室聚碳酸酯膜的LV-shiASPP細(xì)胞較兩對(duì)照組UT細(xì)胞和LV-shNon細(xì)胞明顯減少(56±4vs111±3，105±8)(P＜0.01)，而兩對(duì)照組間的差異不明顯(P＞0.05)。
　　結(jié)論:沉默iASPP的表達(dá)，能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)G0/G1期捕獲，從而抑制Tu686細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖能力，并減弱其侵

14、襲能力，提示iASPP在頭頸鱗癌的發(fā)生及惡性進(jìn)展中發(fā)揮了重要的作用。
　　第三章、沉默iASPP基因的表達(dá)對(duì)頭頸鱗癌細(xì)胞紫杉醇化療敏感性的影響
　　目的:探討沉默iASPP基因的表達(dá)后，對(duì)頭頸鱗癌Tu686細(xì)胞紫杉醇化療敏感性的影響。
　　方法:以不同濃度的紫杉醇藥物作用于UT細(xì)胞、LV-shNon細(xì)胞和LV-shiASPP細(xì)胞，48小時(shí)后，采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況，繪制各組細(xì)胞的生存曲線，計(jì)算各組細(xì)胞

15、紫杉醇作用的IC50值，及紫杉醇作用UT細(xì)胞的IC30值。以紫杉醇IC30濃度處理UT細(xì)胞、LV-shiASPP細(xì)胞和LV-shNon細(xì)胞，24小時(shí)后行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期情況。
　　結(jié)果:
　　1.LV-shiASPP細(xì)胞、UT細(xì)胞和LV-shNon細(xì)胞紫杉醇作用的IC50值分別為3.84±0.28 nM/L，47.46±2.12 nM/L和50.93±2.27 nM/L，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01

16、)，表明LV-shiASPP細(xì)胞對(duì)紫杉醇的化療敏感性明顯較對(duì)照組UT細(xì)胞和LV-shNon細(xì)胞增強(qiáng)，而UT細(xì)胞和LV-shNon細(xì)胞紫杉醇作用的IC50值相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.以UT細(xì)胞紫杉醇作用的IC30濃度分別作用于三組細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示LV-shiASPP細(xì)胞的凋亡率較UT和LV-shNon細(xì)胞明顯增多（18.27±1.13％ vs7.31±0.33％，8.20±0.34％），且差異具有

17、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。同時(shí)，LV-shiASPP細(xì)胞中處于G2/M期的細(xì)胞比例較UT和LV-shNon細(xì)胞顯著增多（28.68±0.76％vs19.21±0.89％，17.99±0.13％）(P＜0.01)，而處于S期的細(xì)胞比例顯著減少（15.11±1.09％ vs26.38±2.04％，26.58±0.67％）(P＜0.01)，G0/G1期細(xì)胞比例變化不大（56.21±1.82％ vs54.41±1.15％，55.42±0.56