網(wǎng)織血小板檢測方法的改進(jìn)及其在血液疾病診斷中的應(yīng)用.pdf

1、研究背景： 1969年Ingram和Cooper smith在對失血性Beagle犬的外周血經(jīng)新亞甲藍(lán)染色的鏡檢中，觀察到部分清晰的濃染網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的血小板，被命名為網(wǎng)織血小板(Reticulated platelet，簡稱RP)<'[1]>。網(wǎng)織血小板是由骨髓巨核細(xì)胞新近釋放入外周血的血小板<'[2]>，不含核或DNA成分，卻含有少量的mRNA和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，保留了合成少量蛋白質(zhì)的能力，它反映了循環(huán)中最年輕的血小板<'[3]>。近年

2、來，隨著網(wǎng)織血小板檢測方法的不斷改進(jìn)，流式細(xì)胞儀和網(wǎng)織細(xì)胞檢測儀在臨床上的廣泛應(yīng)用，使其在機(jī)體造血功能中的臨床意義的得以深入研究，成為分析血小板的生成狀態(tài)的有用指標(biāo)<'[1]>。但是由于目前國內(nèi)外網(wǎng)織血小板檢測的方法還未統(tǒng)一，檢測過程復(fù)雜，參考值也有較大的差異，臨床應(yīng)用受到了一定的限制。 目的： 在上述研究背景下，我們通過實驗設(shè)計來探討以下幾個問題： 1．應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測網(wǎng)織血小板的方法。在現(xiàn)有流式細(xì)胞技術(shù)基

3、礎(chǔ)上，比較全血和血漿標(biāo)本檢測網(wǎng)織血小板的差異，并對檢測方法進(jìn)行改進(jìn)，確定噻唑橙檢測網(wǎng)織血小板的最佳條件，簡化檢測方法。 2．確定流式細(xì)胞技術(shù)檢測網(wǎng)織血小板的正常人群的參考值，比較男性和女性參考值差異性。 3．對網(wǎng)織血小板與血小板相關(guān)參數(shù)(平均血小板體積MPV、血小板分布寬PDW、大血小板比例P-LCR)結(jié)果之間的關(guān)系進(jìn)行探討。 4．初步探討網(wǎng)織血小板在血小板減少性疾病鑒別診斷中的臨床意義，通過網(wǎng)織血小板的檢測，區(qū)

4、分不同病因引起的血小板減少性疾病，從而進(jìn)行病因分析。 方法： 1．探討流式細(xì)胞儀檢測網(wǎng)織血小板的方法； 探討流式細(xì)胞儀檢測RP的方法，并對網(wǎng)織血小板的檢測方法進(jìn)行改進(jìn)，通過析因設(shè)計的方差分析確定噻唑橙檢測網(wǎng)織血小板的最適合的檢測條件，用CD42b-PE單抗標(biāo)記血漿及全血中的血小板，再用熒光染料噻唑橙(thiaZolorange，TO)染色網(wǎng)織血小板內(nèi)RNA。以流式細(xì)胞儀對RP百分率進(jìn)行檢測。 分別對全血及

5、血漿樣本在不同TO濃度及孵育時間下的網(wǎng)織血小板進(jìn)行測定，確定網(wǎng)織血小板測定的最佳TO濃度及孵育時間。 在一定檢測條件下，比較全血和血漿檢測網(wǎng)織血小板的差異。對一樣本進(jìn)行10次連續(xù)性測定，檢測其CV值，驗證該方法的重復(fù)性。 2．確定網(wǎng)織血小板的正常參考值； 以100例健康人做為正常對照組(其中男性50例，女性50例)，對正常對照組的RP百分率及RP絕對值進(jìn)行檢測。并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，從而對男性和女性的結(jié)果差異進(jìn)

6、行比較。 3．對RP百分比與血小板相關(guān)參數(shù)(MPV、PDWP-LCR)的結(jié)果之間的關(guān)系進(jìn)行分析： 通過對147例樣本的網(wǎng)織血小板與MPV、PDW、P-LCR的檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析，比較他們的相關(guān)性。并將MPV>11.0f1組的RP％與正 MPV(11.0f1組進(jìn)行比較，比較兩者的差異性。 4．初步探討網(wǎng)織血小板對血小板減少性疾病的鑒別診斷的臨床意義； 對不同原因造成的血小板減少的病人進(jìn)行網(wǎng)織血小板測定，繼

7、而對血小板減少的原因進(jìn)行分析，從中找出網(wǎng)織血小板對血小板減少性疾病的鑒別診斷價值。入選病例為特發(fā)性血小板減少性紫瘢(idiopa，thic thrombocytoperlicpurptlra，ITP)12例、再生障礙性貧血(aplastic arlemia，AA)12例、急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)36例、急性非淋巴細(xì)胞白血病(actlte non-lymphocytic leuke

8、mia，ANLL)30例、骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syridrome，MDS)5例、慢性粒細(xì)胞白血病(chronicmyelocytic letJkemia，CML)8例。對這些病人的血小板總數(shù)及網(wǎng)織血小板百分比及絕對值進(jìn)行測定，對男性與女性結(jié)果進(jìn)行分組與正常對照組結(jié)果進(jìn)行比較。對不同類型血液疾病的網(wǎng)織血小板結(jié)果進(jìn)行分析，對網(wǎng)織血小板反映骨髓血小板生成狀況的情況進(jìn)行評估。 結(jié)果： 1．我們通過

9、析因設(shè)計的方差分析，發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞儀測定RP的結(jié)果受到T0濃度及孵育時間的影響，隨著T0濃度的提高及孵育時間的延長RP的結(jié)果呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。通過析因設(shè)計的方差分析表明在T01:2稀釋的條件下60min與90min時間段內(nèi)RP％檢測結(jié)果差異較其它組小，因而選擇T01:2稀釋條件下孵育60min作為測定時條件，實驗條件相對較容易控制。在該條件下能夠較好的區(qū)分網(wǎng)織血小板，且結(jié)果穩(wěn)定；并且對比了18例血漿和全血的檢測結(jié)果，相關(guān)系數(shù)0.997，

10、二者顯著相關(guān)，并對二者結(jié)果進(jìn)行成對樣本的t檢驗，P>0.05，二者無顯著性差異，該方法重復(fù)性CV％為1.32％，重復(fù)性好，因而適合于臨床檢測網(wǎng)織血小板。 2．檢測了100例健康人RP％，結(jié)果為： 9.72％±2.59％(x±SD)，其中男性50例，RP％為9.15％±2.01％，女性50例，RP％為10.29％±2.97％。女性的結(jié)果高于男性，P<0.05，男女間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。用血小板總數(shù)乘以網(wǎng)織血小板百分比可得于網(wǎng)織血小

11、板絕對值，100例正常人的網(wǎng)織血小板絕對值(RP)為：21.29±6.75(×10<'9>/L)，其中男性50例，RP為19.46±5.52(×10<'9>/L)，女性50例，RP為23.13±7.39(×10<'3>/L)。女性的結(jié)果高于男性，P<0.05，男女間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 3．通過對147例標(biāo)本(男性組72例、女性組75例)同時檢測RP％及MPV、PDW、P-LCR，RP％與MPV的檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析，男性組：Y

12、=0.407，P<0.001，女性組：Y=0.452，P<0.001，RP％與MPV之間呈正相關(guān)關(guān)系。在MPV≥11.0f1組的RP％為13.63％±6.15％，MPV<11.0f1組的RP％為9.80％±4.56％，P=0.001，二者具有顯著性差異。RP96與PDW及P-LCR也均呈現(xiàn)相關(guān)關(guān)系。 4．12例ITP病人RP％測量結(jié)果為28.87％±8.91％(范圍從15.16％-44.9896)，明顯高于正常對照組，4例治療后

13、的ITP病人RP％為9.06％±3.8796，與正常對照組無差異；12例AA的RP％為5.96％±3.01％(范圍從2.50％-14.49％)，低于正常對照組，RP絕對值為1.57±1.90(×10<'9>/L)，結(jié)果明顯低于正常對照組。36例ALL組RP％為12.20％±5.33％，30例ANLL組RP％為10.83％±5.16％，與正常對照組相比，無顯著性差異(P>0.05)；8例慢性粒細(xì)胞白血病RP絕對值為：139.67±80.0

14、6(×10<'9>L)，RP絕對值明顯高于正常對照組(P=0.000)。5例MDS病人RP％為21.75％±7.37％，高于正常對照組(P<0.05)。 5．RP％與骨髓巨核細(xì)胞相關(guān)性分析：分析了6例病人骨髓巨核細(xì)胞檢測結(jié)果，并與RP％結(jié)果進(jìn)行了對照分析，發(fā)現(xiàn)6例病人的網(wǎng)織血小板的檢查結(jié)果與骨髓巨核細(xì)胞檢查結(jié)果相符。 結(jié)論： 1．應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測外周血網(wǎng)織血小板的最佳T0濃度為1:2稀釋、染色時間為60分鐘，

15、此時能夠較好的區(qū)分網(wǎng)織血小板，且實驗條件容易控制，適合于臨床檢測。 2．在以上條件下，使用全血和富血小板血漿檢測結(jié)果接近，二者均適合于流式細(xì)胞技術(shù)常規(guī)檢測網(wǎng)織血小板。使用全血作為檢測物可以簡化實驗步驟，減少操作過程對檢測結(jié)果的干擾。 3．正常對照組男性網(wǎng)織血小板值低于女性，二者間數(shù)值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 4．MPV、PDW和P-LCR與RP％有一定的相關(guān)關(guān)系，MPV高于11.0f1組RP％高于MPV小于11.0f

16、1組，提示血小板體積增大的病人RP％增高。 5．RP％在不同血液疾病中的測定結(jié)果顯示RP％對于血小板減少性疾病的病因診斷有一定參考價值，ITP病人RP96顯著增高，而AA病人RP絕對值減低，CML病人RP絕對值顯著增加，其結(jié)果與骨髓巨核細(xì)胞的數(shù)量具有一定的相關(guān)性，通過RP96的檢測，可以間接的判斷骨髓巨核細(xì)胞的生成狀況，從而對血小板減少的原因進(jìn)行分析。 本研究的主要創(chuàng)新點： 1．在國內(nèi)首先采用CD42b-PE單抗

17、與T0雙標(biāo)記檢測全血中網(wǎng)織血小板，改進(jìn)了流式細(xì)胞技術(shù)檢測網(wǎng)織血小板的方法。探討了全血標(biāo)本檢測網(wǎng)織血小板的條件，簡化了檢測步驟。 2．建立正常人群全血標(biāo)本網(wǎng)織血小板的參考值。 3．通過對RP％與P-LCR進(jìn)行比較，找出了兩者之間的相關(guān)性。 4．首次在國內(nèi)報道了RP％直接與骨髓巨核細(xì)胞數(shù)量的研究結(jié)果，為骨髓造血功能的測定提供了一個較簡便的臨床應(yīng)用指標(biāo)。 5．觀察了RP和RP％在ITP病人組、從病人組和CML病