豬瘟間接ELISA和豬瘟及主要繁殖障礙病的熒光PCR技術(shù)的研究.pdf

1、對(duì)豬瘟抗體水平檢測(cè)是制定合理的免疫程序，監(jiān)測(cè)疫苗免疫效果的基礎(chǔ)。本研究利用豬瘟病毒(CSFV)免疫優(yōu)勢(shì)蛋白E2蛋白具有4個(gè)獨(dú)立的抗原結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)，將E2的免疫活性區(qū)域進(jìn)行原核表達(dá)。采用PCR技術(shù)，從已構(gòu)建好的含有E2全長(zhǎng)基因的S21質(zhì)粒中分別擴(kuò)增出E2蛋白的4個(gè)抗原決定域，并克隆入ptMAL-p2X載體中，構(gòu)建了4個(gè)原核表達(dá)載體E2-abcd／pMAL-p2X、E2-ala2／pMAL-p2X、E2-b／pMAL-p2X和E2-c／pM

2、AL-p2X。通過(guò)對(duì)四種表達(dá)菌的篩選，最后選擇BL21-CodonPlus(DE3)-RP作為受體表達(dá)菌。電泳結(jié)果顯示均獲得可溶性表達(dá)，目的蛋白的表達(dá)量占總蛋白的15％-30％。將重組的目的蛋白進(jìn)行親和層析純化，作為包被抗原，初步建立了檢測(cè)豬瘟抗體的間接ELISA方法。實(shí)驗(yàn)證明，該方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的CSF陽(yáng)性及陰性血清的具有良好的敏感性。 豬瘟感染確診的主要依據(jù)是對(duì)CSFV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。因此，本研究設(shè)計(jì)了多種探針和引物，初步建立了雙重

3、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，檢測(cè)包括CSFV在內(nèi)的4種可引起繁殖障礙的病毒，即豬瘟病毒(CSFV)，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)，豬偽狂犬病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)。實(shí)驗(yàn)證明，所設(shè)計(jì)的探針和引物具有良好的特異性。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)各種病原的敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，檢測(cè)CSFVcDNA的敏感性達(dá)2-3，而nest-PeR的敏感性可達(dá)2-9；檢測(cè)PRRSVcDNA的敏感性達(dá)2-2，而nest-PCR的敏感性可達(dá)2-5；實(shí)時(shí)熒光PCR檢