水貂犬瘟熱病毒的分離鑒定及其F基因的原核表達(dá).pdf

1、本文分三部分對水貂犬瘟熱病毒的分離鑒定及其F基因的原核表達(dá)進(jìn)行了研究： 1.取一發(fā)病水貂的肝、脾、腦等組織研磨后用Vero和BHK細(xì)胞分離病毒，2-3代后細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的CPE，電鏡檢查發(fā)現(xiàn)了典型的副粘病毒樣粒子，大小約150nm。IFA試驗(yàn)和RT-PCR檢測均為陽性，證明分離毒是一株犬瘟熱病毒。進(jìn)一步研究顯示：該毒株的TCID50為10-4.87，對鵝、雞、小鼠、家兔、山羊、豬紅細(xì)胞均無凝集性。分離株病毒對乙醚、氯仿敏感，不耐

2、酸、不耐熱，病毒的核酸型為RNA。將PCR得到的部分F基因克隆到pMD18-T載體上進(jìn)行測序，將其與疫苗株Onderstepoort、國外水貂分離株1493-89進(jìn)行序列比較。 2.用試驗(yàn)一的針對CDV的F基因保守區(qū)設(shè)計的引物F、R，分別以陽性長春株和水貂分離株的RNA為模板，建立了Real-timePCR方法來檢測CDV，確定特異性產(chǎn)物的Tm值。 3.以從水貂分離株中提取的RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得一約100

3、0bp的F基因片段。將此片段插入到pET-32a質(zhì)粒中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-32a-F，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定為陽性后，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)中，經(jīng)1.0mMIPTG在30℃的條件下誘導(dǎo)，目的基因獲得了高效表達(dá)。SDS-PAGE電泳顯示表達(dá)產(chǎn)物分子量約為55KD，大小與預(yù)期相符；WesternBlotting試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，該基因獲得了正確表達(dá)。使用His-BindResins純化系統(tǒng)對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到了較純的目