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1、浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文家蠶BmCH基因的原核表達(dá)和亞細(xì)胞定位研究姓名：梁莉惠申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：張耀洲20091201浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文AbStractAcDNAsequencewasscreenedfromaBombyxmoricDNAlibraryconstructedbyourlaboratory，whichcontainsaCHCHdomainidentifiedafterblastba
2、sedonNCBIdatabaseWepreliminarynominatedthisnovelgeneasBmCH(BombyxmoriBraCt1)(GenBankaccessionnumberisABF515141、ItcontainsallORFof435bpandencodes144aminoacidswiththepredictedmolecularweightof1482kDaandisoelectricpointof85
3、49AccordingtotheORFofBmCHtwoprimersweredesignedtOobtainthecodingregionofBmCHgeneTheORFofthegeneWasclonedintopET28a()vector、析thEcoRIandXhoIdigestTherecombinantplasmidwastransformedintoEcoliRosetta(DE3)PCRanddigestionwithE
4、coRI／XhoIshowedthatthedesignedfragmentWasinsertedcorrectlyRecombinantproteinwasexpressedandsuccessfullyinducedbyIPTGTheanalysisofSDS—PAGEshowedthatthefusionproteinHisBmCHWasexpressed11iglllyinRosettawithabout20kDaThefusi
5、onproteinformedtheinclusionbodiesandthenwaspurifiedwimmetal—chelatingaffinitychromatographyPolyclonalantibodyWasgeneratedbyimmunizationofNewZealandrabbitwithfusionproteinThetiteroftheantiserumcanreach1：12800withahighspec
6、ificitybyexperimemofELISAWeuseWesternblotandreal—timefluorescentquantitativePCRtoanalyzethetranscriptionallevelandtheexpressionlevelofBmCHindevelopmentalstagesanddifferenttissuesofthefifthinstarlarvaofBombyxmoriOurresult
7、ssuggestedthatBmCHWasexpressedinthefourstages，wimhighestinlarva；infifthinstarlarvathepositivesignalofBmCHwasdetectedobviouslyinepidermis，gut，testis，Malpighiantubule，ovary，thesignalinblood，silkglands，fatbody，butnotdetecte
8、dintracheaandheadTheresultsweresimilarteal—timefluorescentquantitativePCRFinallywecarriedoutthesubcellularlocalizationaboutBmCHinBmNcellandpositivesignalofBmCHwasmostlyfoundinthecytoplasmTheseresultslaidagoodfoundationof
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