灰葡萄孢BcPDR1基因調(diào)控病菌致病力的功能研究.pdf

1、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）是一種典型的死體營養(yǎng)型植物病原真菌，能引起至少235種植物的灰霉病，常給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。挖掘灰葡萄孢的致病相關(guān)基因，探究其致病的分子機制，可為制定持久控制灰霉病的策略提供理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。試驗室前期研究從灰葡萄孢T-DNA插入突變體庫中篩選獲得了一株致病力完全喪失的突變體BCt89，利用TAIL-PCR、Southern blotting、RT-PCR等技術(shù)結(jié)合生物信息學方法，明

2、確了其突變基因為BcPDR1，該基因編碼一個功能未知的假定蛋白，無同源基因和保守結(jié)構(gòu)域。為進一步明確該基因的功能及其在致病過程中的作用，本研究利用基因敲除技術(shù)，獲得了該基因的敲除突變體△BcPDR1;通過對突變體BCt89和△BcPDR1的表型和致病性的分析，明確了BcPDR1基因在病菌生長、發(fā)育和致病過程中的功能。通過對突變體BCt89和△BcPDR1的胞壁降解酶活性、毒素活性、產(chǎn)酸能力、附著胞形成與穿透能力、NO產(chǎn)生和轉(zhuǎn)運能力等分析

3、，確定病菌BcPDR1基因缺失后喪失致病力的機制。為闡明BcPDR1基因調(diào)控病菌致病力的分子機制及其為灰霉病的防治奠定基礎(chǔ)。
　　 1.試驗構(gòu)建了BcPDR1基因的同源重組載體，利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化灰葡萄孢野生型菌株BC22，利用潮霉素B篩選轉(zhuǎn)化子，通過PCR、Southernblotting和RT-PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)化子進行驗證。確定了所獲得的陽性轉(zhuǎn)化子為BcPDR1基因的敲除突變體△BcPDR1。
　　

4、2.以野生型菌株BC22為對照，對突變體BCt89和△BcPDR1進行表型分菥和致病性測定，發(fā)現(xiàn)突變體BCt89和△BcPDR1的生長速度減慢，不產(chǎn)生分生孢子和菌核，菌絲纖細、分隔短、顏色淺，且突變體的致病力完全喪失，確定了BcPDR1基因參與調(diào)控病菌的生長、發(fā)育和致病性。
　　 3.對突變體BCt89和△BcPDR1的胞壁降解酶活性、毒素活性、產(chǎn)酸能力及NO產(chǎn)生和轉(zhuǎn)運能力進行分析，發(fā)現(xiàn)突變體的Cx、PG和PMG的酶活性較野生型

5、明顯降低，PGTE、PMTE的酶活性及毒素活性與野生型相比沒有明顯差別;突變體的產(chǎn)酸能力較野生型明顯增強;突變體的NO產(chǎn)生部位和轉(zhuǎn)運能力與野生型有明顯差別。確定了BcPDR1基因突變影響病菌胞壁降解酶活性、產(chǎn)酸能力及NO的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)運，不影響病菌的毒素活性。
　　 4.對突變體BCt89和△BcPDR1的附著胞形成與穿透能力進行觀察，發(fā)現(xiàn)突變體均能穿透玻璃紙和洋蔥表皮，且均能形成附著胞和侵入菌絲，但是突變體的附著胞形成和侵入菌絲的

6、產(chǎn)生時間均較野生型延遲。表明BcPDR1基因?qū)Σ【街男纬膳c穿透能力具有一定的調(diào)控作用。
　　 5.利用RT-PCR技術(shù)，檢測突變體BCt89和△BcPDR1中致病相關(guān)基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)突變體中產(chǎn)酶相關(guān)基因glyox1、cutA、bcpg1和bcpg2的表達水平均較野生型明顯增強，god1基因的表達減弱;信號途徑相關(guān)基因pka、pka2、bac、btp1、ras2的表達明顯增強，edka、bcp1基因的表達減弱;產(chǎn)毒相關(guān)基

7、因P450-1和bcbot1的表達明顯增強;產(chǎn)黑色素相關(guān)基因lac1的表達明顯減弱。表明BcPDR1基因缺失影響病菌致病相關(guān)基因的表達。
　　 6.對突變體BCt89和△BcPDR1對非生物脅迫的敏感性進行測定，發(fā)現(xiàn)在山梨醇、甲萘醌培養(yǎng)基上，突變體BCt89和△BcPDR1受抑制的程度顯著低于野生型;在氟康唑的培養(yǎng)基上，突變體△BcPDR1受抑制的程度顯著低于野生型;在NaCl、KCl、甘油、剛果紅和H2O2的培養(yǎng)基上，突變體B