腸炎沙門(mén)菌C50041crp、spiC基因缺失株的構(gòu)建及其免疫生物學(xué)特性研究.pdf

1、沙門(mén)菌引起的食源性疾病，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。家禽是沙門(mén)菌的主要宿主之一，因此，加強(qiáng)家禽沙門(mén)菌病的防控研究，不僅能保證家禽的生產(chǎn)性能，而且能夠從源頭減少人因攝入沙門(mén)菌而導(dǎo)致的疾病。
　　近年來(lái)，利用基因工程技術(shù)，將病原菌相關(guān)基因敲除，構(gòu)建新型減毒沙門(mén)菌作為疫苗的研究備受關(guān)注。新型減毒活疫苗具有免疫力堅(jiān)實(shí)、免疫期長(zhǎng)等特點(diǎn)，在預(yù)防控制沙門(mén)菌的感染方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。
　　本研究通過(guò)λRed重組系統(tǒng)和自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)同源重組的方法

2、，分別將腸炎沙門(mén)菌C50041株毒力相關(guān)基因spiC和代謝相關(guān)基因crp敲除，構(gòu)建相應(yīng)的單基因和雙基因缺失突變菌，并評(píng)價(jià)了其生物學(xué)特性，探索了這些突變株作為減毒活疫苗的可行性。
　　1腸炎沙門(mén)菌C50041 crp、spiC基因缺失株構(gòu)建與鑒定
　　以腸炎沙門(mén)菌C50041基因組為模板，PCR擴(kuò)增出crp基因上游925bp DNA序列，以及crp基因下游936bpDNA序列。將上游片段、Cm抗性基因片段及下游片段連接，成功構(gòu)

3、建重組質(zhì)粒pMD-⊿crp/Cm。以重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增打靶片段，其中間為Cm抗性基因，為兩端crp基因同源臂。在λRed重組系統(tǒng)協(xié)助下，將野生型C50041的crp基因敲除，在Cm抗性平板上篩選陽(yáng)性克隆。電轉(zhuǎn)化編碼FLP重組酶的溫度敏感型質(zhì)粒pCP20，轉(zhuǎn)入上述篩選獲得的陽(yáng)性克隆中，以去除Cm抗性基因。PCR和測(cè)序鑒定結(jié)果表明，crp基因缺失株C50041⊿crp構(gòu)建成功。通過(guò)重組自殺質(zhì)粒pGMB151-⊿spiC/Km介導(dǎo)的同源重組

4、，進(jìn)一步敲除腸炎沙門(mén)菌C50041和C50041⊿crp突變株的spiC基因，成功構(gòu)建C50041⊿spiC和雙缺失株C50041⊿crp⊿spiC/Km。對(duì)3株缺失菌的生化特性、生長(zhǎng)特性以及毒力等的鑒定結(jié)果表明，spiC基因的缺失對(duì)C50041的生化特性與生長(zhǎng)特性無(wú)顯著影響;但crp基因缺失后，C50041對(duì)多種糖類(lèi)物質(zhì)的代謝情況發(fā)生改變，且生長(zhǎng)速度顯著下降。細(xì)菌C50041⊿spiC的LD50約為2.87×106 CFU，C5004

5、1⊿crp的LD50約為3.89×106 CFU，C50041⊿crp⊿spiC/Km的LD50約為5.36×106 CFU，3個(gè)缺失株之間差別不顯著，但與C50041野生株LD50（約為3.11×103 CFU）相比較而言，升高了約1，000倍左右。
　　2腸炎沙門(mén)菌C50041缺失株免疫生物學(xué)特性研究
　　選取小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7為模型進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與野生株相比，3株突變菌對(duì)RAW264.7細(xì)胞的

6、黏附力明顯降低，但3株突變菌之間差異不顯著(p＞0.05）;3株突變菌對(duì)RAW264.7細(xì)胞的侵襲力明顯降低，C50041⊿crp⊿spiC/Km和C50041⊿crp與C50041⊿spiC缺失株之間存在極顯著差異(p＜0.01），C50041⊿crp⊿spiC/Km與C50041⊿crp缺失株之間存在顯著差異(p＜0.05）。將3株缺失菌和野生菌以肌肉注射方式接種1日齡雛雞，在肝臟，各缺失株在第10天均檢測(cè)不到;在脾臟，以雙缺失菌C

7、50041⊿crp⊿spiC/Km最先被清除，C50041⊿crp缺失株其次，C50041⊿spiC缺失株持續(xù)時(shí)間最久;而野生型C50041在接種后第6天全部死亡。
　　利用間接ELISA檢測(cè)血清中IgG抗體，結(jié)果顯示，3個(gè)突變菌免疫后第1周均可以檢測(cè)到IgG抗體，免疫后第2周達(dá)到高峰，此后抗體水平均略有下降。小腸黏膜抗體sIgA的檢測(cè)結(jié)果顯示，C50041⊿spiC免疫組在免疫后第2周可以檢測(cè)到sIgA抗體，而C50041⊿cr