穩(wěn)定表達(dá)牛Mx1蛋白BHK-21細(xì)胞株的構(gòu)建及其抗口蹄疫病毒活性分析.pdf

1、Mx蛋白是由I型干擾素誘導(dǎo)宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的一種抗病毒蛋白質(zhì),該蛋白屬于GTP酶活性的動(dòng)態(tài)蛋白超家族成員之一。Mx蛋白具有廣譜的抗病毒活性,目前已相繼發(fā)現(xiàn)了鼠、人、牛、羊、魚等不同物種的Mx蛋白,并檢測到其對(duì)流感病毒(Influenza virus,IV)、水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)、托高土病毒(Thogoto virus)及乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)等多

2、種RNA病毒與少數(shù)DNA病毒增殖的抑制作用。
　　口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)是國際獸醫(yī)局(OIE)規(guī)定的A類動(dòng)物病原微生物之一,能引起偶蹄動(dòng)物口蹄疫。該病具有高度傳染和持續(xù)性感染的特性,對(duì)偶蹄動(dòng)物的健康和生產(chǎn)性能危害極大,嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn),I型干擾素對(duì)多種病毒的復(fù)制具有較強(qiáng)的抑制作用,是脊椎動(dòng)物抵抗病毒感染的一道重要防線。已經(jīng)有研究證明,I型干擾素主要依賴其誘導(dǎo)的

3、抗病毒蛋白2',5'-寡腺苷酸合成酶(OAS-1)和蛋白激酶(PKR)對(duì)FMDV的復(fù)制產(chǎn)生抑制作用。Mx蛋白是隨后發(fā)現(xiàn)的由I型干擾素誘導(dǎo)的第三種抗病毒蛋白,該蛋白在機(jī)體抗FMDV感染中的作用目前尚不清楚。為了證實(shí)牛Mx1蛋白是否具有抗FMDV活性,本研究克隆了牛Mx1基因,將其定向插入原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá),獲得了重組牛Mx1融合蛋白,免疫小鼠后制備了抗牛Mx1蛋白特異性抗體;構(gòu)建了pcDNA3.1/bMx1真核表達(dá)載體,將

4、真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,經(jīng)過G418篩選,獲得了穩(wěn)定表達(dá)牛Mx1蛋白的重組BHK-21細(xì)胞株,并在該細(xì)胞株上檢測了牛Mx1蛋白抗FMDV活性。研究方法和主要結(jié)果如下:
　　1.牛Mx1基因的克隆、原核表達(dá)及其抗體制備:采用RT-PCR方法從中國荷斯坦奶牛外周血淋巴細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出牛Mx1基因,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)KpnI、XhoI雙酶切后插入原核表達(dá)載體pET-32a(+)中;對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-32a/bMx1進(jìn)行PCR

5、、酶切和測序鑒定后,將其轉(zhuǎn)化至工程菌BL21(DE3)中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE和蛋白免疫印跡(Western blot)分析;用Ni柱純化融合蛋白,將純化的蛋白加佐劑后免疫小鼠,制備抗血清,瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢測抗體效價(jià)。結(jié)果成功克隆了牛Mx1基因編碼區(qū),構(gòu)建了牛Mx1基因原核表達(dá)載體pET-32a/bMx1;轉(zhuǎn)化后的BL21(DE3)在28℃、1.0mmol/L IPTG濃度條件下誘導(dǎo)6h時(shí),SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在相

6、對(duì)分子質(zhì)量約90kDa的位置出現(xiàn)預(yù)期大小一致的蛋白條帶,表達(dá)量占菌體總蛋白量的28％;Western blot檢測到表達(dá)的牛Mx1重組蛋白能與牛Mx1蛋白抗體特異性結(jié)合;瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢測,牛Mx1融合蛋白免疫小鼠后制備的抗血清效價(jià)為1∶32。
　　2.穩(wěn)定表達(dá)牛Mx1蛋白的BHK-21細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定:將牛Mx1基因cDNA克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+);通過脂質(zhì)體將構(gòu)建好的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/bMx1和空載體p

7、cDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞,并用G418篩選;篩選出的陽性細(xì)胞經(jīng)PCR、RT-PCR、Western blot及間接免疫熒光(IFA)從分子、蛋白水平鑒定牛Mx1基因在細(xì)胞中的表達(dá);傳20代后再次用PCR、RT-PCR檢測其遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1/bMx1,篩選出的陽性細(xì)胞與正常細(xì)胞相比形態(tài)與生長速度無差別;PCR、RT-PCR均擴(kuò)增出約1947bp目的片段;Western blot約在7

8、5kDa處檢測到一條特異性蛋白條帶,與預(yù)期大小相符;IFA結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組陽性BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)了的熒光,而陰性對(duì)照組細(xì)胞沒有熒光的表達(dá);PCR、RT-PCR可以從傳20代后的陽性BHK-21細(xì)胞中擴(kuò)增出目的片段。結(jié)果提示,牛Mx1基因在構(gòu)建的重組BHK-21細(xì)胞株內(nèi)獲得表達(dá),且具有遺傳穩(wěn)定性。
　　3.牛Mx1蛋白抗FMDV活性分析:用100TCID50O型FMDV感染重組BHK-21細(xì)胞,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定攻毒后12h

9、、24h、36h和48hFMDVVP1基因的相對(duì)拷貝數(shù);然后測定不同時(shí)間點(diǎn)病毒的滴度(TCID50);用間接免疫熒光(IFA)檢測攻毒后20h時(shí)FMDV在細(xì)胞內(nèi)的含量。與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比,表達(dá)牛Mx1蛋白的重組BHK-21細(xì)胞發(fā)生病變的時(shí)間延遲,細(xì)胞病變(CPE)減輕。在攻毒后12h、24h、36h和48h,FMDV VP1基因的相對(duì)表達(dá)量分別下降了45%、60%、25%、10%;TCID50測定結(jié)果顯示表達(dá)牛Mx1蛋白的重組BHK-

10、21細(xì)胞內(nèi)病毒滴度低于陰性對(duì)照組,其中在攻毒后24h時(shí),陰性對(duì)照細(xì)胞組TCID50是表達(dá)牛Mx1蛋白重組BHK-21細(xì)胞的10倍左右;IFA檢測結(jié)果顯示表達(dá)牛Mx1蛋白重組BHK-21細(xì)胞內(nèi)的熒光量和強(qiáng)度低于陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):牛Mx1蛋白能有效抑制FMDV的增殖。
　　本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)牛Mx1蛋白的BHK-21細(xì)胞株,并研究了其抗FMDV活性,為揭示牛Mx1蛋白抗FMDV作用的分子機(jī)制及抗FMDV家畜分子育種新材料