弓形蟲-偽狂犬病毒重組二價(jià)基因工程疫苗研究.pdf

1、弓形蟲病(Toxoplasmosis)是由剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)引起的、在世界范圍內(nèi)廣泛流行的人獸共患寄生蟲病。貓是弓形蟲的終末宿主,會(huì)排出感染性的卵囊,卵囊被認(rèn)為是弓形蟲感染的主要來源之一。人經(jīng)食物、飲水等途徑攝入卵囊而感染。不過,也有越來越多的研究將目光關(guān)注于人通過食用含有T.gondii組織包囊的肉及肉制品而感染弓形蟲的風(fēng)險(xiǎn)。免疫預(yù)防是控制弓形蟲病的主要手段,但由于弓形蟲復(fù)雜的生活史中有著多種多樣的因素對

2、弓形蟲免疫產(chǎn)生影響,目前弓形蟲的免疫預(yù)防研究進(jìn)展不大。在弓形蟲病診斷方面,盡管已有很多方法用于弓形蟲的檢測,但在臨床實(shí)際應(yīng)用中缺乏操作簡便、快速且不需要昂貴儀器的病原學(xué)診斷方法。為此本研究對T.gondii LAMP病原學(xué)診斷方法及T.gondii-PRV二價(jià)基因工程疫苗進(jìn)行了研究,主要研究結(jié)果如下:
　　 1.弓形蟲LAMP檢測方法的建立
　　 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal ampl

3、ification,LAMP)是由日本學(xué)者Notomi于2000年發(fā)明的一種新型體外恒溫核酸擴(kuò)增方法,主要是利用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域,在等溫條件下進(jìn)行高效擴(kuò)增反應(yīng)?；虻臄U(kuò)增和產(chǎn)物的檢測可一步完成。目前,該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、動(dòng)物原蟲等疾病的檢測。
　　 本研究中,我們針對弓形蟲MIC3基因(GeneBank No.EU572718)設(shè)計(jì)了一組引物,包括有內(nèi)引物對、外引物對以及促環(huán)引物對,通過一

4、系列反應(yīng)條件的篩選建立了弓形蟲LAMP病原診斷方法。敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法能檢測到的極限值為0.4個(gè)速殖子,特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。利用該方法和B1-based Nested-PCR同時(shí)檢測320份臨床采集的豬的血液和組織樣品,其陽性檢出率分別為11.6％和9.69％,說明LAMP方法更為敏感。另外利用該方法檢測豬肉樣品中弓形蟲的感染,在某屠宰場的45份樣品中檢測出9份陽性,而在5個(gè)市場收集的68份樣品檢出3份陽性

5、,這些結(jié)果說明,豬肉中弓形蟲感染的風(fēng)險(xiǎn)是切實(shí)存在的。上述結(jié)果表明基于弓形蟲MIC3基因的LAMP診斷方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn),加上該方法具有操作省時(shí)、省力,不需要昂貴的儀器,因此具有很好的推廣應(yīng)用前景。
　　 2.表達(dá)弓形蟲SAG1、MIC3和GRA7基因的重組偽狂犬病病毒的構(gòu)建
　　 偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)是一種能引起多種動(dòng)物以發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎為主要癥狀的病毒,由該病毒

6、引起的豬偽狂犬病是目前危害全球養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一。偽狂犬病病毒基因缺失標(biāo)志疫苗是目前應(yīng)用最為成功的動(dòng)物標(biāo)志疫苗之一,同時(shí)也是良好的基因工程重組疫苗載體,迄今為止,已有幾十種外源基因在PRV中得到表達(dá)。
　　 本研究中,分別將經(jīng)PCR方法擴(kuò)增的SAG1、MIC3和GRA7全基因插入到PRV gG-缺失通用轉(zhuǎn)移載體pgG-Uni的多克隆位點(diǎn)中以構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pgG-SAG1、pgG-MIC3和pgG-GRA7。然后再將上述質(zhì)粒與P

7、RV TK-/gG-/EGFP+基因組共轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞,病變后經(jīng)空斑純化得到重組病毒TK-/gG-/SAG1(MIC3,GRA7)+。通過Western blotting檢測重組病毒中外源基因的表達(dá)。結(jié)果表明重組病毒構(gòu)建正確,且外源基因得到了正確表達(dá)。重組病毒的TCID50測定結(jié)果表明,外源基因的插入不影響重組病毒在IBRS-2細(xì)胞上的增殖。重組病毒傳代30代后外源基因仍然存在,同時(shí)以不同劑量接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沒有出現(xiàn)毒力增強(qiáng)現(xiàn)象,這些

8、結(jié)果說明重組病毒具有很好的遺傳穩(wěn)定性和安全性。
　　 3.重組病毒作為疫苗的免疫效果及保護(hù)力
　　 利用構(gòu)建的三株重組病毒單獨(dú)或聯(lián)合免疫小鼠,所有接種重組病毒的小鼠都產(chǎn)生對弓形蟲裂解抗原(TLA)特異性的抗體,伴隨著很強(qiáng)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),并且IFN-γ和IL-2的量明顯上升。這些結(jié)果說明重組偽狂犬病毒能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生很強(qiáng)的體液免疫和Th1型的細(xì)胞免疫。免疫攻擊實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組偽狂犬病毒免疫后能使小鼠產(chǎn)生抵抗致死性RH株弓形