非編碼小RNA(RyhB)調(diào)控禽致病性大腸桿菌生物學(xué)表型分析及靶蛋白的篩選.pdf

1、禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic Escherichia coli，APEC)是一種能引起家禽局部或全身性傳染病的細(xì)菌，能與很多病毒性疾病和其他細(xì)菌性疾病并發(fā)。隨著世界集約化養(yǎng)雞行業(yè)的發(fā)展，大腸桿菌病的發(fā)病率和死亡率也逐步升高，給養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展造成了巨大的損失。在大腸桿菌研究中，人們提出了一種新的基因調(diào)節(jié)子，即為非編碼小RNA(small non-coding regulatory RNA，sRNA)，其在轉(zhuǎn)錄后可調(diào)節(jié)基

2、因的表達(dá)水平，主要參與的調(diào)節(jié)途徑包括轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控、鐵代謝途徑、糖代謝途徑、膜蛋白生物合成、群體感應(yīng)系統(tǒng)以及致病菌的致病力調(diào)節(jié)等。而RyhB也是小RNA的一種，在細(xì)菌致病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵作用。此外，RyhB除了參與調(diào)節(jié)鐵代謝外，在霍亂弧菌和痢疾志賀氏菌中，還發(fā)現(xiàn)RyhB的還能調(diào)控細(xì)菌動(dòng)力、化學(xué)趨化、生物膜、酸性耐受力、氧化還原甚至毒力基因的表達(dá)等。因此，研究RyhB與APEC致病性之間的聯(lián)系，為防控大腸桿菌病提出實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本

3、研究以實(shí)驗(yàn)室RyhB缺失株為基礎(chǔ)，研究RyhB缺失條件下對(duì)細(xì)菌的生物學(xué)特性的影響，并利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較野生株與缺失株差異表達(dá)的蛋白，篩選出影響APEC毒力等相關(guān)特性的相關(guān)靶基因，進(jìn)一步揭示了RyhB與APEC致病力之間的關(guān)系。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、sRNA-RyhB對(duì)禽致病性大腸桿菌生物學(xué)特性影響
　　本實(shí)驗(yàn)分別從生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)、組織載菌量實(shí)驗(yàn)、菌體超顯微結(jié)構(gòu)觀察實(shí)驗(yàn)、生物被膜形成能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、LPS完整性實(shí)驗(yàn)

4、、環(huán)境耐受力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)等來(lái)研究禽致病性大腸桿菌RyhB對(duì)細(xì)菌的生物學(xué)特性影響。生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RyhB沒(méi)有影響其生長(zhǎng)性能;組織載菌量實(shí)驗(yàn)表明，注入△RyhB肝臟組織載菌量相比野生株的肝臟組織載菌量降低了6.91倍;超顯微結(jié)構(gòu)觀察實(shí)驗(yàn)表明，同樣的生長(zhǎng)條件下，親本菌AE17有完整的菌毛，而缺失株則沒(méi)有完整菌毛;生物膜試驗(yàn)結(jié)果表明，RyhB基因缺失后，生物膜的形成能力減弱，回復(fù)株有所回復(fù)，但并沒(méi)有回到野生株生物膜形成能力;LPS完整性實(shí)驗(yàn)

5、結(jié)果表明RyhB缺失沒(méi)有影響有LPS的完整性;環(huán)境耐受力實(shí)驗(yàn)表明，缺失株△RyhB對(duì)氧化不敏感，熱應(yīng)激增強(qiáng)，耐酸性增強(qiáng)，耐堿性減弱。
　　2、sRNA-RyhB調(diào)控禽致病性大腸桿菌靶蛋白的篩選
　　為探索RyhB可能調(diào)控的毒力基因。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，從蛋白水平比較野生株和缺失株之間差異蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與野生株相比，共發(fā)現(xiàn)62個(gè)差異蛋白。其中Omsc、Galu、Nlpe、Tata、GmhA、proX、inFA、cys

6、E可能是RyhB直接調(diào)控的毒力相關(guān)基因。通過(guò)GO(Gene Ontology)分類結(jié)果顯示，差異表達(dá)蛋白參與的細(xì)胞組分包括細(xì)胞膜、胞外區(qū)、細(xì)胞器、核質(zhì)組成等;分子功能主要表現(xiàn)抗氧化功能、蛋白結(jié)合、催化活性、分子功能調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能等;參與的生物學(xué)過(guò)程主要包括調(diào)控生物調(diào)節(jié)、運(yùn)動(dòng)過(guò)程、新陳代謝過(guò)程、多細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程、應(yīng)激反應(yīng)、單一生物體調(diào)節(jié)過(guò)程等。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)其中10個(gè)差異蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)一

7、致。
　　3、sRNA-RyhB調(diào)控禽致病性大腸桿菌酸性耐受力以及影響生物膜形成靶蛋白分析
　　本實(shí)驗(yàn)基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，篩選得到與酸性耐受力有關(guān)的蛋白，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)篩選的差異蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。在篩選出的差異蛋白的基礎(chǔ)上，結(jié)合在線預(yù)測(cè)軟件篩選可能直接作用的與生物膜形成有關(guān)的靶蛋白。實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了pET28a-cysE表達(dá)載體，獲得可溶性cysE蛋白，用Western B

8、lot檢測(cè)重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物，在蛋白大小約36kDa處有一條蛋白帶，表明表達(dá)產(chǎn)物有良好的特異性。
　　以上研究結(jié)果表明，RyhB的缺失能影響禽致病性大腸桿菌菌毛的表達(dá)并降低肝臟的載菌量、降低生物膜的形成、增強(qiáng)熱應(yīng)激、增強(qiáng)耐酸性、減弱耐堿性。表明RyhB在調(diào)控APEC毒力作用中扮演重要角色，并結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出與生物膜形成、酸性耐受力有關(guān)的蛋白。為后續(xù)研究RyhB調(diào)控靶點(diǎn)奠定了一些基礎(chǔ)，同時(shí)也為進(jìn)一步研究APEC的致病作用及宿主