葡萄根瘤蚜的熒光定量PCR檢測(cè)及間種植物防控研究.pdf

1、葡萄根瘤蚜Daktulosphaira vitifoliae(Fitch)，屬于同翅目(Homoptera)，根瘤蚜科(Phylloxeridae)，原產(chǎn)于北美洲落基山脈東部，是葡萄上的毀滅性害蟲(chóng)，為專食性害蟲(chóng)，只危害vitis屬植物，是我國(guó)植物檢疫性有害生物。1935年在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)葡萄根瘤蚜后，通過(guò)采取砍伐葡萄，使葡萄根瘤蚜銷聲匿跡，2005年在我國(guó)再次發(fā)生葡萄根瘤蚜危害。目前世界上主要利用嫁接抗性砧木防治葡萄根瘤蚜，沒(méi)有其他有效防

2、治方法。由于我國(guó)葡萄大多以扦插方式栽培，嫁接抗性砧木面積較少，葡萄根瘤蚜對(duì)我國(guó)迅速發(fā)展的葡萄產(chǎn)業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。同時(shí)，目前主要依靠常規(guī)土壤及根系調(diào)查葡萄根瘤蚜，但常規(guī)地面方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，為了給葡萄根瘤蚜監(jiān)測(cè)提供快速、準(zhǔn)確、敏感性高的分子生物學(xué)調(diào)查方法，以及為葡萄根瘤蚜防控探索有效的方法，本試驗(yàn)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)葡萄根瘤蚜、以及在葡萄園間作植物防控葡萄根瘤蚜進(jìn)行了研究。主要結(jié)果總結(jié)如下：
　　 1.參考Karen He

3、rbert等的方法，根據(jù)葡萄根瘤蚜ITS2中的保守序列設(shè)計(jì)的特異性引物與TaqMan-MGB熒光探針，通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證上述引物和探針適用于我國(guó)葡萄根瘤蚜的檢測(cè)，并且成功構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，制作出以標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了一種絕對(duì)定量檢測(cè)葡萄根瘤蚜的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。并對(duì)該方法進(jìn)行敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，該方法的靈敏度可達(dá)1.625 copies/μl，3次重復(fù)檢測(cè)的變異系數(shù)均小于5％。提取0.25 g含有

4、10頭葡萄根瘤蚜若蟲(chóng)土壤的DNA，并將其梯度稀釋，用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，將DNA稀釋103倍后，仍能檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)，對(duì)受害葡萄根際土壤檢測(cè)結(jié)果也為陽(yáng)性。葡萄根瘤蚜TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)具有特異性強(qiáng)，敏感性高，易操作等優(yōu)點(diǎn)，有很好的應(yīng)用前景和研究?jī)r(jià)值。
　　 2.按照殺蟲(chóng)活性，經(jīng)濟(jì)合理性，耐陰性，植株高度等篩選原則，選取裂葉荊芥、黃芩和黃芪三種植物作為防控葡萄根瘤蚜的間作植