禽病原性大腸桿菌E516株與尿道致病性大腸桿菌U56株毒力基因相關性與體內外表達差異的研究.pdf

1、尿道感染是一種嚴重危害人類健康的常見病，40％-50％的婦女至少經歷過一次尿道感染，臨床表現多樣(尿道炎、膀胱炎、腎盂腎炎等)，僅在美國，每年即有大約8百萬人罹患該病，住院患者約30萬。迄今，尿道致病性大腸桿菌(uropathogenic Escherichia coli，UPEC)是所有尿道感染中最常見的病原體。禽大腸桿菌病是部分或全部由禽病原性大腸桿菌(avian pathogenic Escherichia coli，APEC)引

2、起的局部或全身性感染的疾病，包括大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌肉芽腫(Hjarre氏病)、氣囊病(慢性呼吸道病，CRD)、禽蜂窩織炎、腫頭綜合癥、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及臍炎/卵黃囊感染。
　　 APEC和UPEC均能引起腸道外感染，具有廣泛的致病潛能?；谶@種廣泛的致病潛能，UPEC和APEC被歸為新型致病性大腸桿菌——腸道外病原性大腸桿菌(extraintestinal pathogenic Escherichia

3、coli，ExPEC)。APEC和UPEC引起腸道外感染可能與它們的毒力特性有關，如黏附素、鐵攝取系統(tǒng)、毒素、保護素和侵襲素等，這些毒力特性使它們能夠在宿主環(huán)境中生存進而產生疾病。諸多研究證明，APEC和UPEC的毒力因子之間存在著一定的相似性。
　　 本研究選取代表性APEC、UPEC分離株，比較它們的種系發(fā)生分型及毒力基因的分布，并通過SPF雞對它們的致病性進行鑒定，同時比較APEC和UPEC在雞和小鼠體內外競爭性生長情況；

4、通過感染實驗小鼠和雞，應用相對定量反轉錄PCR測定受試毒力基因在體內的表達水平，從而揭示APEC、UPEC毒力基因在同一宿主體內的表達規(guī)律，最終為弄清APEC與UPEC是否作為對方毒力基因貯庫這一關鍵問題提供依據。相對定量PCR對APEC和UPEC毒力基因在體內表達水平的檢測結果，結合PCR檢測毒力基因的分布以及對SPF雞致病性試驗的結果，說明APEC和UPEC在毒力基因方面的相關性。
　　 ⑴APEC E516株和UPEC U

5、56株毒力、毒力基因相關性的研究。選取同屬O1血清型禽致病性大腸桿菌分離株E516和人尿道致病性大腸桿菌U56株，應用單一和多重PCR技術比較它們的種系發(fā)生分型及毒力基因的分布，并通過SPF雞對它們的致病性進行鑒定，同時以腸出血性大腸桿菌代表菌株933和非致病性大腸桿菌代表菌株K-12 MG1655作對照；并比較APEC E516株和UPEC U56株在雞和小鼠體內外競爭性生長情況。結果顯示，E516株和U56株種系發(fā)生型一致，在毒力基

6、因相似性高；對1日齡SPF雞致病力測定結果表明U56株能產生與E516株相似的病變，但是致病力略低于E516；雞和小鼠體內競爭性試驗結果顯示U56競爭力略低于E516，這可能與兩者仍存在不同的已知或未知的毒力因子有關。上述研究部分佐證了APEC可能是UPEC的來源或UPEC的毒力基因儲存庫的推論。
　　 ⑵檢測ompT和feoB相對定量PCR方法的建立及其在體內外表達水平的解析。本研究用嵌合熒光(SYBR GreenⅠ)標記，以

7、編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶的看家基因gapA為內參基因，建立了用于ompT和feoB基因表達水平解析的兩步法實時定量反轉錄PCR(real time quantitative reverse transcription polymerase chainreaction,qRT-PCR)。運用該定量PCR分別建立了內參基因gapA和目的基因ompT與feoB的3個標準曲線，這些標準曲線的斜率和線性關系均符合要求，表明所建立的定量PCR體系的

8、擴增效率高、定量準確。定量PCR對ompT和feoB基因在感染雞體內及小鼠體內的表達水平的解析結果表明，相對于體外培養(yǎng)，APEC E516株ompT在雞體內和小鼠體內的表達分別上調了3.73和1.45倍，feoB在雞體內上調了1.30倍，在小鼠體內表現下調趨勢，下調率為0.84；UPEC U56株ompT在雞體內和小鼠體內的表達分別上調了1.52和2.57倍，feoB在雞體內和小鼠體內的表達分別上調了2.15和1.37倍；而對照菌株EH