雛鵝新型病毒性腸炎病毒強毒生物學(xué)特性研究.pdf

1、雛鵝新型病毒性腸炎(newtypegoslingviralenteritis，NGVE)是一種主要發(fā)生于30日齡以內(nèi)的雛鵝的一種以小腸出血性、纖維素性、滲出性、壞死性炎癥為特征的急性傳染病。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、病理剖解、病原的分離、初步鑒定、病毒提純與負染電鏡觀察其形態(tài)學(xué)特征、及病毒結(jié)構(gòu)蛋白分析等一系列研究，初步認為該病是由禽腺病毒引起的雛鵝的一種新型病毒性腸炎。該病目前對養(yǎng)鵝業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。關(guān)于鵝腺病毒，特別是致病的鵝腺病毒，目前

2、國內(nèi)外的研究資料很少。電子顯微學(xué)技術(shù)是研究病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)、鑒定新病毒、闡明病毒的發(fā)育循環(huán)、研究感染宿主病理學(xué)的一個重要方法，它在病毒學(xué)研究中具有不可替代的作用。本研究首先將NGVEV鵝胚尿囊液適應(yīng)10日齡鴨胚，再將NGVEV鴨胚尿囊液適應(yīng)體外培養(yǎng)的鴨胚成纖維細胞(DEF)，并對病毒在感染鴨胚體內(nèi)及DEF細胞上的形態(tài)特征和病毒形態(tài)發(fā)生學(xué)進行系統(tǒng)地研究，同時觀察被感染宿主細胞的超微結(jié)構(gòu)病變和細胞凋亡的情況，以期了解NGVEV的入侵、分布及釋放

3、特點，為揭示該病毒致宿主細胞病變的機制提供科學(xué)依據(jù)。
　　 通過人工感染NGVEV-CN強毒而復(fù)制出NGVE急性病例，建立并利用間接免疫酶組織化學(xué)SP法及間接免疫熒光抗體法探究NGVEV對感染雛鵝組織的侵染特點及病毒抗原隨感染時間延伸在宿主體內(nèi)的動態(tài)分布規(guī)律，同時對病毒誘導(dǎo)雛鵝宿主的細胞凋亡進行檢測，以期為闡明該病的發(fā)病機制提供實驗數(shù)據(jù)及為NGVEV的實驗室診，斷提供科學(xué)的方法。
　　 將制備的NGVEV滅活疫苗及添加G

4、oIL-2的NGVEV滅活疫苗免疫青年鵝，對其誘導(dǎo)鵝產(chǎn)生的體液免疫抗體水平和細胞免疫抗體水平進行了監(jiān)測，確定了該疫苗的免疫原性和最佳免疫劑量。進而將該疫苗免疫開產(chǎn)前種鵝，對免疫種鵝的血清抗體水平、免疫種鵝的后代卵黃抗體消長規(guī)律及后代雛鵝的攻毒免疫保護力進行監(jiān)控，為研制高效NGVEV滅活疫苗提供科學(xué)依據(jù)，為防治雛鵝新型病毒性腸炎的提供了新的手段。
　　 本研究獲得以下系列結(jié)果：
　　 1.雛鵝新型病毒性腸炎病毒CN強毒株感

5、染鴨胚宿主細胞的超微結(jié)構(gòu)變化和病毒形態(tài)發(fā)生學(xué)：在不同時間剖殺的和死亡的鴨胚的尿囊膜、心、肝、腸、腦及肌胃中均發(fā)現(xiàn)NGVEV粒子，其直徑以70nm-80nm為主，以散在的形式分布，多見于細胞核內(nèi)。NGVEV粒子通過與細胞膜的特異性吸附而進入宿主細胞，裝配成熟的病毒粒子通過細胞核膜及細胞膜破裂的方式被釋放。被NGVEV感染宿主細胞的超微結(jié)構(gòu)病變以細胞核膜嚴重的擴張，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腫脹，線粒體嵴斷裂溶解成空泡樣為主，其中尿囊膜上皮細胞中線粒體的凝集

6、、固縮變化是該病毒引起的特征性超微病變。
　　 2.雛鵝新型病毒性腸炎病毒CN強毒株對體外培養(yǎng)的鴨胚成纖維細胞的適應(yīng)及其增殖規(guī)律：將NGVEV鴨胚尿囊液感染DEF細胞并經(jīng)連續(xù)傳代獲得了適應(yīng)DEF細胞生長的NGVEV-CN細胞毒。細胞病變一般出現(xiàn)于感染后72h，到120h細胞病變達80％。NGVEV在DEF上的病毒滴度(TCIDso)隨傳代次數(shù)增加而逐漸增加，直到第5代后維持在較高的水平。病毒滴度隨感染時間變化表現(xiàn)為：感染初期首先

7、呈現(xiàn)一個下降過程，4h后毒價開始迅速上升，于96h-144h病毒滴度達到并維持最高水平。NGVEV感染DEF細胞后96h-120h是收獲該NGVEV細胞毒的最適時間。
　　 3.雛鵝新型病毒性腸炎病毒CN強毒株感染鴨胚成纖維細胞的超微結(jié)構(gòu)變化和病毒形態(tài)發(fā)生學(xué)：NGVEV在DEF細胞中呈圓形，無囊膜，直徑為75nm-90nm。病毒粒子多散在于細胞核內(nèi)和集中分布于胞漿空泡內(nèi)。NGVEV粒子通過吸附于DEF細胞膜表面而進入細胞，成熟的

8、病毒粒子經(jīng)由細胞核膜的破裂而進入胞漿，再通過出芽、細胞膜破裂及細胞空泡破裂的方式被釋放出細胞。被NGVEV感染的DEF細胞的超微結(jié)構(gòu)病變主要表現(xiàn)為：線粒體的固縮及聚集變化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，胞漿出現(xiàn)空泡或空池樣結(jié)構(gòu)，及細胞凋亡現(xiàn)象。伴隨著病毒的復(fù)制、裝配和成熟，細胞中還出現(xiàn)大量的不規(guī)則形狀的高電子致密物及三種不同特點的胞漿包涵體結(jié)構(gòu)。
　　 4.雛鵝新型病毒性腸炎病毒CN強毒株致體外培養(yǎng)的鴨胚成纖維細胞凋亡：光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡

9、觀察到NGVEV可誘導(dǎo)DEF細胞出現(xiàn)典型的細胞凋亡形態(tài)學(xué)變化；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測到感染細胞核酸降解為不同倍數(shù)的180bp-200bp的典型梯狀條帶；用AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記感染DEF細胞經(jīng)流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)凋亡細胞的比率從感染后48h隨感染時間延伸而明顯增加，于120h達到凋亡峰，而AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記的感染DEF細胞經(jīng)熒光顯微鏡可觀察陽性熒光信號的凋亡細胞。
　　 5.雛鵝新型病毒性腸炎病毒

10、的提純、超微形態(tài)觀察和兔抗NGVEV高免血清IgG的鋇備：通過對NGVEV純化方法的比較研究，確定以結(jié)合差速離心、氯仿處理、氯化銫不連續(xù)梯度和等密度梯度超速離心的方法來純化NGVEV。通過該方法不僅可獲得較純凈、多量的NGVEV粒子，還可區(qū)分完整的NGVEV粒子和不完整的病毒粒子。經(jīng)負染電鏡觀察發(fā)現(xiàn)完整的NGVEV粒子具有腺病毒典型形態(tài)特征：圓形，無囊膜，直徑75nm-90nm，核心、核衣殼及殼粒清晰可見。最后，以純化的病毒為免疫原成功

11、制備了兔抗NGVEV的高免血清，并通過辛酸-硫酸銨粗提及HighO陰離子交換柱純化兔抗NGVEV的血清IgG。
　　 6.建立并應(yīng)用間接免疫酶組織化學(xué)SP法和間接免疫熒光抗體法檢測雛鵝新型病毒性腸炎病毒在人工感染雛鵝組織的定位和侵染規(guī)律：以純化的兔抗NGVEV的血清IgG為一抗，分別建立檢測石蠟切片NGVEV的間接免疫酶組織化學(xué)SP法和間接免疫熒光雙染法，并應(yīng)用該方法研究NGVEV-CN強毒株在人工感染雛鵝組織中病毒定殖及動態(tài)侵

12、染規(guī)律。結(jié)果表明：NGVEV抗原主要侵染免疫器官（法氏囊，胸腺，哈德氏腺及脾）和胃腸道器官（腺胃，肌胃及腸道），推測這些器官是NGVEV進入機體后首先侵染靶部位并增殖子代病毒，之后子代病毒通過血液、淋巴液或組織液而釋放到其他實質(zhì)性組織，使得機體在感染后期呈現(xiàn)NGVEV廣泛性侵染（除呼吸器官）。被NGVEV侵染的細胞數(shù)量隨感染時間延長而增加，直到感染后15d。NGVEV侵染的細胞主要包括：各種淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細

13、胞、成纖維細胞、粘膜細胞、腺細胞等等。
　　 7.雛鵝新型病毒性腸炎病毒CN強毒株致雛鵝宿主細胞凋亡的研究：通過光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡對人工感染雛鵝各個組織的宿主細胞觀察發(fā)現(xiàn)，最先于NGVEV感染3d時在法氏囊中觀察到呈凋亡變化的淋巴細胞，之后凋亡細胞廣泛出現(xiàn)于免疫器官（法氏囊，胸腺及哈德氏腺）和消化器官（腺胃，肌胃，腸道及肝），而氣管和肺極少出現(xiàn)細胞凋亡變化。進一步用瓊脂糖凝膠電泳和原位末端標(biāo)記方法（TUNEL）對NGVEV感

14、染宿主細胞核酸的降解情況進行了檢測，發(fā)現(xiàn)被感染鵝的免疫器官和胃腸道均出現(xiàn)典型的不同倍數(shù)的180bp-200bp的梯狀條帶，在經(jīng)TUNEL染色的組織切片中觀察到了棕色陽性信號的凋亡細胞。凋亡細胞的數(shù)量隨感染時間延長而增多，于9d-12d達到最大值。
　　 8.雛鵝新型病毒性腸炎病毒滅活疫苗對青年鵝的免疫原性研究及重組GoIL-2對疫苗的佐劑效應(yīng)研究：不同劑量的NGVEV滅活疫苗均能顯著提高免疫青年鵝的細胞免疫和體液免疫抗體水平，且

15、抗體水平與免疫劑量有一定關(guān)系，NGVEV滅活疫苗以o.5ml/只為最佳免疫劑量。單獨使用GoIL-2可提高機體的細胞免疫水平，但是不能使機體產(chǎn)生特異性抗NGVEV抗體。添加不同劑量GoIL-2的NGVEV滅活疫苗能極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)提高被免疫鵝細胞免疫和體液水平，且抗體水平與GoIL-2劑量有一定關(guān)系，以1000U/只為最佳劑量。研究表明，免疫后第28d青年鵝的血清抗NGVEV的IgG水平、中和抗體水平及細胞免

16、疫水平達到最高，且在免疫后第175d都維持在一個較高的水平。
　　 9.雛鵝新型病毒性腸炎病毒滅活疫苗對開產(chǎn)前種鵝的免疫效果評價：NGVEV滅活疫苗與添加GoIL-2的NGVEV滅活疫苗免疫后5-6個月內(nèi)對免疫種鵝所產(chǎn)后代產(chǎn)生確實的保護效果，其中以添加GoIL-2的滅活疫苗免疫種鵝所孵出的后代雛鵝的攻毒100％免疫保護效果更持久。另外，被免疫母鵝血清抗體水平、其所產(chǎn)蛋的卵黃抗體水平與后代雛鵝攻毒免疫保護效果呈現(xiàn)正相關(guān)性，因此建議