石斑魚虹彩病毒(SGIV)囊膜蛋白組學及兩個新結(jié)構(gòu)蛋白基因的鑒定和功能初步研究.pdf

1、新加坡石斑魚虹彩病毒(SGIV)是一種重要的魚類傳染性病毒，可導致石斑魚死亡率達90％以上，給石斑魚的養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟損失。形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理生化及全基因組序列分析揭示SGIV為虹彩病毒科蛙病毒屬的一個新種。SGIV是具有囊膜的大分子DNA病毒，囊膜在病毒感染、復制及致病過程中起重要作用。研究囊膜蛋白對于闡明病毒感染和致病的分子機理具有重要的科學意義，也可為有針對性地研究和開發(fā)病毒防控技術(shù)提供理論依據(jù)。
　　 本研究通過純化病毒

2、SGIV，用Triton X-100處理純病毒成功分離囊膜后，采用兩種方法對SGIV囊膜蛋白組進行系統(tǒng)研究。通過1-DE-MALDI workflow鑒定分離的囊膜蛋白，初步發(fā)現(xiàn)9個病毒編碼的蛋白。通過LC-MALDI workflow鑒定發(fā)現(xiàn)19個囊膜蛋白，其中4個蛋白是經(jīng)兩種方法均得到驗證的。發(fā)現(xiàn)的24個囊膜蛋白中，12個蛋白是首次被鑒定發(fā)現(xiàn)。進一步分析鑒定的囊膜蛋白中15個蛋白(62.5％)含有跨膜區(qū)，4個蛋白白虹彩病毒科核心基因

3、編碼。
　　 我們進一步對質(zhì)譜初步鑒定的囊膜蛋白 SGIV VP90進行了深入研究。從SGIV基因組中克隆了ORF090L全長基因，并進行了原核表達，重組蛋白純化和免疫小鼠制備抗體。通過RT-PCR、Western-blot分析，結(jié)合藥物抑制實驗，揭示ORF090是一個晚期基因。免疫熒光顯微鏡觀察，結(jié)果顯示該基因表達在GP細胞的細胞質(zhì)中。免疫電鏡結(jié)果進一步表明VP90定位于病毒囊膜。體外抗體中和實驗揭示VP90在病毒感染過程中可

4、能起重要作用。
　　 為了弄清病毒結(jié)構(gòu)蛋白在病毒感染中的作用，結(jié)合生物信息學分析，我們選取ORF038L作為候選基因進行研究，SGIV ORF038L編碼170個氨基酸，含有一個保守的RGD結(jié)構(gòu)域。從SGIV全基因組中克隆了ORF038全長基因，進行了原核表達，并免疫小鼠制備出抗體。轉(zhuǎn)錄表達時序分析表明，SGIV ORF038L在感染細胞后8h開始轉(zhuǎn)錄，24h開始表達。結(jié)合藥物抑制實驗，揭示ORF038是一個晚期基因。免疫熒光顯