豬丹毒桿菌安徽株生物學(xué)特性及Real-Time PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬丹毒是一種歷史久遠(yuǎn)的細(xì)菌性傳染病，在我國(guó)已有20余年很少見到。然而，近年來在我國(guó)廣東、江蘇、福建、云南、湖南、湖北、安徽等地區(qū)均有豬丹毒發(fā)病增多的報(bào)道。同時(shí)，該病在美國(guó)、日本、巴西等國(guó)家的發(fā)生也明顯增多，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究針對(duì)2012?2015年安徽地區(qū)臨床分離鑒定的42株豬丹毒桿菌首先進(jìn)行流行病學(xué)信息調(diào)查，并采用瓊脂擴(kuò)散沉淀實(shí)驗(yàn)鑒定血清型；PCR和序列分析技術(shù)檢測(cè)spaA基因遺傳變異性；脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）對(duì)

2、優(yōu)勢(shì)菌基因分型；微量肉湯稀釋法檢測(cè)藥物敏感性；吖啶黃抗性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)吖啶黃敏感性，旨在了解當(dāng)前安徽地區(qū)豬丹毒的流行特點(diǎn)以及致病菌株的差異，為豬丹毒致病菌的分子流行病學(xué)研究提供數(shù)據(jù)支撐，為安徽地區(qū)豬丹毒的防治提供理論依據(jù)；同時(shí)在國(guó)內(nèi)首次采用SYBR Green I染料法建立豬丹毒桿菌Real-Time PCR檢測(cè)方法，為安徽地區(qū)豬丹毒的流行病學(xué)及分子生物學(xué)研究提供必要的技術(shù)支持。
　　結(jié)果顯示：安徽地區(qū)豬丹毒在2-10月份均有發(fā)生，峰期

3、為7-9月份，臨診癥狀主要表現(xiàn)為急性敗血癥（92.9％）；42株豬丹毒桿菌分離株血清型均為1a型；表面保護(hù)性抗原A基因（spaA）與豬丹毒桿菌國(guó)內(nèi)外參考株核苷酸序列同源性為98.5%?100%，分離株均為Met-203、Ile-257型；分離株形成8個(gè)PFGE基因型，相似度達(dá)88.8%?100%，優(yōu)勢(shì)基因型為ER2（54.8%），弱毒疫苗G4T10和GC42株獨(dú)立為同一個(gè)基因型；分離株對(duì)青霉素類、喹諾酮類及氯霉素類藥物的敏感率均在80%

4、以上，而對(duì)氨基糖苷類和林克酰胺類藥物的耐藥率在80%以上，100%的菌株可耐受4種及以上的藥物，耐受5種及以上藥物的比例達(dá)95.2%，其中以GEN+KAN+STR+CLI+LIN的構(gòu)成比最大，為76.2%；有4株（9.5%）分離菌株具有吖啶黃抗性；建立的Real-Time PCR與豬源常見細(xì)菌無非特異性擴(kuò)增，檢測(cè)限度為20拷貝的核酸，比普通PCR高100倍以上，組內(nèi)及組間重復(fù)變異系數(shù)在0.22-2.09之間，Real-Time PCR對(duì)

5、小鼠感染樣品的陽(yáng)性檢出率顯著高于細(xì)菌分離鑒定和普通PCR（P<0.05），臨床病例樣品檢測(cè)顯示Real-Time PCR檢出率顯著高于普通PCR。
　　結(jié)果表明：豬丹毒桿菌安徽株優(yōu)勢(shì)血清型為1a型，spaA基因同源性高，變異小，Met-203、Ile-257型菌株致病力強(qiáng)，是安徽地區(qū)豬丹毒發(fā)生與流行的主要致病菌型；豬丹毒桿菌安徽株P(guān)FGE基因型關(guān)系密切，PFGE基因型與分離地點(diǎn)和分離時(shí)間無明顯相關(guān)性，分離株來源于同一克隆系，但在傳