兩株H5N1亞型流感病毒Sw-FJ-1-01和DK-ZJ-52-00的致病性研究.pdf

1、本試驗(yàn)對(duì)兩株流感病毒Sw/FJ/1/01（FJ01）與DK/ZJ/52/00（ZJ00）進(jìn)行了研究。FJ01能感染小鼠并致小鼠死亡，ZJ00不能感染小鼠。測序發(fā)現(xiàn)它們有23個(gè)氨基酸不同。為了研究FJ01與ZJ00的跨種傳播機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)建立了ZJ00和FJ01的反向遺傳操作系統(tǒng)。分別以兩病毒為背景，用反向遺傳技術(shù)，在293T細(xì)胞上救獲了16個(gè)單基因替換重組病毒。將救獲的16個(gè)病毒以106EID50劑量滴鼻感染小鼠。用ZJ00的PA和M基因

2、替換FJ01相對(duì)應(yīng)的基因，結(jié)果使得RFJ01在小鼠肺臟感染能力降低了104.21倍。反之若用FJ01的PA和M基因來替換ZJ00相對(duì)應(yīng)的基因，結(jié)果使得R ZJ00由不感染小鼠肺臟變?yōu)楦腥?。其它單基因替換的重組病毒對(duì)小鼠感染能力沒有變化。結(jié)果證明M基因和PA基因影響病毒FJ01與ZJ00在小鼠肺臟中的復(fù)制。 為了明確PA和M基因是否同時(shí)影響了病毒FJ01和ZJ00對(duì)小鼠致病力，把M和PA基因同時(shí)替換，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以ZJ00的PA基因

3、和M基因一起替換FJ01的PA基因和M基因，結(jié)果使得病毒RFJ01/ZJ00PA+M在小鼠肺臟不復(fù)制；反之，以FJ01的PA基因和M基因一起替換ZJ00的PA基因和M基因，結(jié)果使得RZJ00/FJ01PA+M能感染小鼠，在肺臟的病毒滴度達(dá)到了2.5LgEID50。試驗(yàn)證明FJ01和ZJ00對(duì)小鼠感染能力是由M和PA基因共同影響的。 為了更深入的研究兩毒株的致病機(jī)理，分析了FJ01和ZJ00的PA和M基因的氨基酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)M2

4、基因有1個(gè)氨基酸不同，PA基因有4個(gè)氨基酸不同。為了確定在感染小鼠時(shí)，具體是PA的哪一個(gè)氨基酸起作用，對(duì)PA的兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，救獲4個(gè)突變病毒。突變病毒對(duì)小鼠的感染結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PA的54位氨基酸由Ⅰ變?yōu)棰鹾?，可使得RFJ01在小鼠肺臟中復(fù)制能力降低10000倍。反之，PA的54位氨基酸由Ⅴ變?yōu)棰窈螅墒沟肦ZJ00對(duì)小鼠由不感染變?yōu)榱烁腥?。PA的330位氨基酸的改變并沒有影響病毒致病性。結(jié)果證明PA基因的54位氨基酸影響著FJ01和Z