大菱鲆養(yǎng)殖環(huán)境細菌多樣性分析及水產(chǎn)病原菌基因芯片檢測體系的構(gòu)建.pdf

1、為完善水產(chǎn)病害預(yù)警監(jiān)測機制，本文在使用宏基因組測序技術(shù)、分離培養(yǎng)及分子靶標鑒定等手段對海水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的致病菌或潛在病原菌存在情況、大菱鲆幼魚腸道及其養(yǎng)殖環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)進行研究的同時，針對水產(chǎn)養(yǎng)殖高度集約化趨勢及水產(chǎn)病害頻發(fā)的現(xiàn)狀，結(jié)合歷史文獻資料，嘗試構(gòu)建檢測靈敏度高、檢測通量大且較為經(jīng)濟的病原菌基因芯片技術(shù)，為實現(xiàn)工廠化養(yǎng)殖過程中的疾病監(jiān)測和預(yù)警提供技術(shù)支持。
　　本論文對2013~2014年間發(fā)生在山東膠南的大菱鲆幼魚腹水癥病原

2、菌進行分離鑒定。結(jié)果從三批患腹水病的幼魚體內(nèi)分離多種優(yōu)勢菌株，經(jīng)人工感染實驗，發(fā)現(xiàn)有一株菌株能夠使大菱鲆幼魚產(chǎn)生腹水、死亡現(xiàn)象，經(jīng)過16S rRNA基因、gyrB基因測序比對，將該株菌鑒定為銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa，其半致死濃度為3.6×108 CFU·mL-1，此為首次報道該菌能夠感染大菱鲆幼魚。
　　以溶血為表征對山東近岸養(yǎng)殖環(huán)境中的潛在條件致病菌進行的篩查結(jié)果為：從養(yǎng)殖環(huán)境中分離鑒定出19株溶

3、血弧菌，以屬于燦爛支系（11/19）、哈維支系（6/19）的弧菌居多，且存在多種已報道的水產(chǎn)病原菌，如哈維氏弧菌、溶藻弧菌、歐文氏弧菌等。通過人工感染實驗發(fā)現(xiàn)兩株歐文氏弧菌、一株哈維氏弧菌表現(xiàn)出一定的毒力，并經(jīng)過毒力基因檢測發(fā)現(xiàn)該三株菌均含有哈維氏弧菌溶血素編碼基因vhhB的同源基因，說明在近岸養(yǎng)殖環(huán)境中存在潛在的條件致病菌。此外通過對分離弧菌的分子鑒定靶標比較，發(fā)現(xiàn)鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白編碼基因fur顯示出較好的分類靶標作用，可以作為弧菌屬分

4、子鑒定的靶標基因。
　　通過對大菱鲆幼魚腸道及其養(yǎng)殖環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，相比于大菱鲆幼魚腸道，養(yǎng)殖水體中細菌多樣性更高，其中假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas、交替單胞菌目某屬unclassified Alteromonadales、假單胞菌屬Pseudomonas、弧菌屬Vibrio、別弧菌屬Aliivibrio的比例較為一致；而在大菱鲆樣本中弧菌屬占優(yōu)勢地位，其次為假單胞菌屬。
　　在結(jié)合上述研究結(jié)果

5、和結(jié)合文獻資料分析的基礎(chǔ)上，本論文構(gòu)建了能夠檢測9種水產(chǎn)病原菌的31種基因的基因芯片，經(jīng)檢測其探針特異性為100％，對親緣關(guān)系較近的菌株間沒有出現(xiàn)交叉反應(yīng)，通過對患病大菱鲆樣本檢測對比，發(fā)現(xiàn)基因芯片檢測的靈敏度較好，能夠分辨出 PCR技術(shù)檢測不出的基因。此外基于多重 PCR技術(shù)，還對基因芯片檢測體系進行優(yōu)化。確定當雜交溫度為60℃、雜交時長為2 h、探針濃度為4μmol·L-1、Cy3標記的隨機引物的用量為150 pmol時，芯片的經(jīng)濟