豬干擾素誘導(dǎo)蛋白IP-10和Mx1克隆、表達(dá)及生物活性檢測(cè).pdf

1、研究表明，干擾素的眾多生物學(xué)功能是通過(guò)其誘導(dǎo)的多種效應(yīng)蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。為了進(jìn)一步研究干擾素抗病毒機(jī)理和研發(fā)抗病毒重組生物藥物，本實(shí)驗(yàn)選取干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中的兩個(gè)——IP-10蛋白和Mx1蛋白進(jìn)行研究。
　　 1.豬干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)的克隆表達(dá)及免疫活性檢測(cè)為了研究重組豬IP-10蛋白的生物學(xué)功能和對(duì)疫苗免疫活性的影響，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR的方法從豬脾臟組織中擴(kuò)增豬IP-10基因，分別克隆到原

2、核表達(dá)載體pGEX-6P-1和真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-HisA。將原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-IP-10轉(zhuǎn)化到大腸桿菌株DH5α中，并用IPTG 于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得表達(dá)，以純化的蛋白做免疫原免疫小鼠，制備出抗IP-10蛋白的陽(yáng)性血清。將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IP-10 轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞后,24h后經(jīng)間接免疫熒光(IFA)和免疫印跡(western blot)檢測(cè)IP-10的表達(dá)。體外微室跨膜遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HEK2

3、93T 細(xì)胞表達(dá)的IP-10 產(chǎn)物對(duì)脾淋巴細(xì)胞的趨化活性，并將有活性的蛋白作為佐劑和疫苗一起免疫動(dòng)物，測(cè)定其對(duì)疫苗免疫的調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)果顯示，雙酶切鑒定和核酸序列分析證實(shí)pGEX-IP-10和pcDNA3.1-IP-10表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。免疫小鼠產(chǎn)生的陽(yáng)性血清稀釋到1:10 萬(wàn)時(shí)A450的值大于未免疫小鼠血清的A450的值即P/N>2.1，說(shuō)明顯示免疫小鼠產(chǎn)生了抗豬IP-10蛋白的抗體即得到了抗IP-10蛋白的高免血清。真

4、核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞后，IFA能夠檢測(cè)到IP-10蛋白的表達(dá)，Western blotting 顯示表達(dá)的融合蛋白分子量約為17KD。體外微室跨膜遷移實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明重組IP-10蛋白對(duì)豬脾淋巴細(xì)胞具有趨化活性，且能產(chǎn)生一定的免疫增強(qiáng)作用。
　　 2.豬Mx1基因的克隆與真核表達(dá)根據(jù)已發(fā)表的Mx1蛋白的cDNA基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)從豬瘟弱毒疫苗和Poly：I

5、C 共刺激7小時(shí)的PK15 細(xì)胞的總RNA中擴(kuò)增出編碼Mx1蛋白的全長(zhǎng)基因，并通過(guò)引物設(shè)計(jì)填補(bǔ)了PK15 細(xì)胞系Mx1 cDNA序列中3'端缺失的11bp，成功獲得Mx1蛋白完整基因的克隆。構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pRetroQ-sMx1，轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞并表達(dá)Mx1蛋白，綠色熒光檢測(cè)和免疫印跡(western blot)檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)，然后利用微量細(xì)胞病變抑制法測(cè)定其抗病毒活性。
　　 結(jié)果顯示，雙酶切鑒定和核酸序列